高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定高粱中蜀黍苷的含量

周韓玲，安明哲，李楊華，宋廷富，劉路宏，廖勤儉，王 芳，郭 艷，王小琴，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓 644007）

生氰糖苷亦稱氰苷、氰醇苷。生氰糖苷是由氰醇衍生物的羥基和D-葡萄糖縮合形成的糖苷，廣泛存在于豆科、薔薇科、稻科的多種植物中[1-2]。苦杏仁苷、亞麻仁苷等都是生氰糖苷的不同形式，存在于高粱中的生氰糖苷則是蜀黍苷[3-5]。

高粱是白酒釀造的重要原料，高粱中的蜀黍苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解或者高溫酸解之后生成β-D-葡萄糖和不穩(wěn)定的對(duì)羥基-（S）-扁桃腈，對(duì)羥基-（S）-扁桃腈在內(nèi)源性α-羥基裂解酶或堿性條件下分解生成對(duì)羥基苯甲醛和HCN[2，6]（圖1）。HCN 與白酒中某些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成氰酸鹽，氰酸鹽進(jìn)一步與乙醇反應(yīng)可生成2A 類致癌物氨基甲酸乙酯（圖2），研究表明，HCN 是白酒中氨基甲酸乙酯的一種前體物質(zhì)[7-8]。因此，定量分析釀酒用高粱中的蜀黍苷對(duì)于研究白酒中氨基甲酸乙酯的生成機(jī)理、提高白酒的品質(zhì)具有重要的意義。

目前檢測生氰糖苷主要方法有液相色譜蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）[9-10]、液相色譜紫外吸收法（HPLC-UV）[11]和HPLC-MS/MS 法[12]，液相色譜法只依靠保留時(shí)間定性，準(zhǔn)確性差，靈敏度低，HPLCMS/MS 法以其準(zhǔn)確性好、靈敏度高等優(yōu)勢在微量成分含量測定中應(yīng)用日益廣泛。本試驗(yàn)采用HPLC-MS/MS 定量分析高粱中的蜀黍苷，以期為研究白酒中氨基甲酸乙酯生成機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：1號(hào)高粱、2號(hào)高粱、3號(hào)高粱，市售。

試劑：甲醇LC-MS 級(jí)，Merck 公司；甲酸LCMS級(jí)，F(xiàn)isher公司；蜀黍苷95%，sigma公司。

儀器設(shè)備：EksigentekspertultraLC 110 液相色譜儀，美國ABSCIEX公司；5500三重四極桿液相質(zhì)譜儀，美國ABSCIEX 公司；5810R 冷凍離心機(jī)，德國Eppendof 公司；YM-060S 超聲波清洗機(jī)，深圳市語盟超聲波清洗機(jī)設(shè)備廠；ML 1602 電子天平，梅特勒-托利多公司；AT 201 電子天平，梅特勒-托利多公司；FSJ-Ⅱ 型錘片式糧食粉粹機(jī)，中儲(chǔ)糧成都糧食貯藏科學(xué)研究院；Milli-Q 超純水制備儀，美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜、質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化：采用針泵進(jìn)樣方式將濃度為100 μg/L 蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)溶液直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源（ESI），分別在正、負(fù)模式下進(jìn)行母離子掃描，根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度確定檢測模式和蜀黍苷的母離子；在production ion 模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，根據(jù)離子碎片的響應(yīng)強(qiáng)度確定定量離子和定性離子；在MRM 模式下，優(yōu)化定量離子和定性離子的去族電壓（DP）和碰撞電壓（CE）。

質(zhì)譜檢測條件：檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓：5500 V，氣簾氣：30 psi；碰撞氣：8 psi；離子源溫度：500 ℃；加熱氣1：50 psi；加熱氣2：50 psi。

液相色譜條件：色譜柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μ m），流速：0.2 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣體積：3 μL。流動(dòng)相是本試驗(yàn)要研究的因素，向流動(dòng)相水-甲醇中添加不同濃度的甲酸、甲酸銨，在不同的流動(dòng)相下進(jìn)樣分析蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜信號(hào)及峰型的影響。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取溶劑的選擇

樣品前處理提取溶劑甲醇水溶液濃度是本試驗(yàn)的處理因素。準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的1 號(hào)高粱9份，每份1.50 g，分別置于9 個(gè)50 mL 離心管中，1～3 號(hào)離心管中加入20 mL 純甲醇，4～6 號(hào)離心管中加入20 mL 95%甲醇水溶液（95∶5，v/v），7～9 號(hào)離心管中加入20 mL 90%甲醇水溶液（90∶10，v/v），所有離心管低溫下超聲1 h后8000 r/min離心10 min，吸取上清液0.4 mL，加入0.8 mL 超純水混勻，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS分析。

1.2.2.2 高粱顆粒預(yù)處理方式的選擇及重復(fù)性試驗(yàn)

當(dāng)組織破壞時(shí)，高粱中的蜀黍苷存在被酶催化分解的可能，試驗(yàn)中采用超低溫研磨法和機(jī)械粉碎法對(duì)比來確定樣品前處理過程中的粉碎方式。超低溫研磨法：稱取1 號(hào)高粱顆粒5 份，每份1.50 g，分別置于研缽中，加入液態(tài)氮后快速研磨至細(xì)粉狀，將研磨好的高粱粉迅速轉(zhuǎn)移到5 支50 mL 離心管中，并加入20 mL 提取液。機(jī)械粉碎法：取1 號(hào)高粱約500 g，粉碎機(jī)粉碎，稱取高粱粉5 份，每份1.50 g，置于50 mL 離心管中，加入20 mL 提取液。將10 支離心管于低溫下超聲1 h，以8000 r/min 離心10 min，吸取上清液0.4 mL，加入0.8 mL 超純水混勻，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 線性方程、檢出限和定量限

用精度為0.00001 g 的電子天平稱取蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品0.00101 g，以甲醇定容至10 mL，配成濃度為101 mg/L 的儲(chǔ)備液（-20 ℃保存），以30%甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為10.1 μg/L、20.2 μg/L、50.5 μg/L、101 μg/L、151.5 μg/L、202 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)HPLC-MS/MS 分析，進(jìn)行回歸分析，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，并計(jì)算檢出限和定量限。

1.2.3.2 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 號(hào)高粱粉樣品，按照1.2.2 中優(yōu)化后的方法處理后連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算精密度。

1.2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 號(hào)高粱粉樣品6 份，分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.2.2 中優(yōu)化后的方法處理，進(jìn)HPLC-MS/MS分析，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.4 實(shí)際樣品的檢測

使用粉粹機(jī)粉粹2 號(hào)高粱、3 號(hào)高粱各500 g，分別稱取兩種高粱粉各1.50 g，經(jīng)提取液提取，上清液稀釋過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS檢測含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

采用針泵進(jìn)樣，優(yōu)化蜀黍苷的質(zhì)譜參數(shù)。采用電噴霧離子源（ESI），在正模式下掃描蜀黍苷的母離子[M+H]+312.2 和[M+NH4]+329.1，在負(fù)模式下掃描[M-H]-310.1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜀黍苷的母離子[M+H]+312.2 響應(yīng)較弱，[M+NH4]+329.1 和[M-H]-310.1響應(yīng)較好，且在相同濃度下，[M+NH4]+329.1 的信號(hào)強(qiáng)度是[M-H]-310.1 的4 倍，因此，最終選擇正模式掃描，以[M+NH4]+329.1 作為蜀黍苷的母離子，見圖3。在production ion 模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜀黍苷母離子[M+NH4]+329.1 的子離子132.1、123.1、180.2、144.9 信號(hào)響應(yīng)均較強(qiáng)，見圖4，最終選擇[M+NH4]+329.1 的兩個(gè)特征子離子132.1和180.2 分別作為蜀黍苷的定量離子和定性離子。在MRM 模式下，優(yōu)化離子132.1 和180.2 的去族電壓（DP）和碰撞電壓（CE），結(jié)果見表1。

表1 蜀黍苷質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 液相色譜條件優(yōu)化結(jié)果

分別以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、5 mmoL 甲酸銨-甲醇、水-甲醇作為流動(dòng)相，進(jìn)樣分析濃度為20.2 μg/L 的蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以水-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，蜀黍苷質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)最好，因此，最終選擇水-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。以0.2 mL/min 的流速，采用表2 中的洗脫梯度進(jìn)行洗脫時(shí)，分離效果較好。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 提取溶劑的選擇

高濃度醇類物質(zhì)可使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而失去活性，甲醇能抑制β-葡萄糖苷酶的活性，可避免蜀黍苷在其作用下水解而導(dǎo)致的定量分析不準(zhǔn)確，加之蜀黍苷在甲醇中具有良好的溶解性，因此，本試驗(yàn)采用甲醇水溶液來提取高粱中的蜀黍苷。分別以甲醇、95%甲醇水溶液和90%甲醇水溶液為提取液，對(duì)粉粹后的1 號(hào)高粱中的蜀黍苷進(jìn)行低溫超聲提取，上清液經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)HPLC-MS/MS分析，結(jié)果見表3。

從表3 可看出，采用90%甲醇水溶液萃取時(shí)，提取液中蜀黍苷測定值較低，其原因可能是提取液中水相比例高，引入了較多的水溶性物質(zhì)，進(jìn)而干擾了目標(biāo)化合物的測定。采用純甲醇作為提取液時(shí)，提取液中蜀黍氰含量略低于采用95%甲醇水溶液作為提取液時(shí)所測值，因此，最終選擇95%甲醇水溶液作為提取液。

2.2.2 高粱顆粒預(yù)處理方式的選擇及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果與分析

氰苷類植物的氰苷和β-葡萄糖苷酶分別位于不同的細(xì)胞中，在正常條件下，氰苷不會(huì)被酶水解，而一旦植物組織遭到破壞，就會(huì)釋放出β-葡萄糖苷酶，在常溫潮濕環(huán)境下，氰苷會(huì)被分解。酶在超低溫下其活性會(huì)受到抑制，本試驗(yàn)選用液態(tài)氮作為β-葡萄糖苷酶的抑制劑，通過超低溫（液態(tài)氮）研磨法和機(jī)械粉粹法兩種處理方式的對(duì)比，來考察樣品粉碎方式對(duì)目標(biāo)化合物含量的影響，見表4。

從表4 可看出，和機(jī)械粉碎法相比，液態(tài)氮研磨法粉碎的樣品提取液中蜀黍苷平均含量略高，但是穩(wěn)定性極差，5 次平行樣測定值的RSD 值高達(dá)18.3%，主要原因可能有：（1）液態(tài)氮研磨法取樣量少，樣品均勻性差；（2）處理過程中樣品難于研磨均勻，5 次平行樣研磨細(xì)度很難保持一致；（3）研磨、轉(zhuǎn)移過程中樣品可能有一定的損耗。相比而言，機(jī)械粉碎法較為穩(wěn)定，5 次平行樣測定值的RSD 僅為2.67%，重復(fù)性好，檢測值僅比液態(tài)氮研磨法低2.0%，說明機(jī)械粉碎過程中樣品的蜀黍苷未進(jìn)行大量的水解。同液氮研磨法相比，機(jī)械粉碎法操作簡單、安全系數(shù)高、處理速度較快，且試驗(yàn)成本較低，最終確定采用機(jī)械粉碎法，在處理前須進(jìn)行原樣烘干，且在粉碎后應(yīng)立即萃取或低溫保存粉狀樣品。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果與分析

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限

進(jìn)樣分析濃度為10.1 μg/L、20.2 μg/L、50.5 μg/L、101 μg/L、151.5 μg/L 和202 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，以濃度X 為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。將濃度為10.1 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)一步稀釋，以信噪比S/N=3時(shí)蜀黍苷的量作為檢出限，信噪比S/N=10 時(shí)蜀黍苷的量作為定量限，線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果見表5。

表3 不同提取液中蜀黍苷含量 (μg/L)

表4 不同處理方式下提取液中蜀黍苷測定結(jié)果

表5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

從表5 可看出，采用HPLC-MS/MS 檢測蜀黍苷，其濃度在10.1～202 μg/L 時(shí)，線性相關(guān)好，相關(guān)系數(shù)（R）不低于0.999，檢出限低，靈敏度高。

2.3.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

1 號(hào)高粱粉樣品經(jīng)處理后連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄峰面積，經(jīng)計(jì)算，蜀黍苷質(zhì)譜峰面積的RSD 值為1.04%，精密度良好。

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表6，從表6 可以看出，3個(gè)不同水平的加標(biāo)回收率分別為96.1%、97.9%和90.7%，均位于90%～100%之間，加標(biāo)回收率良好。

2.4 樣品中含量測定結(jié)果

采用所建立的檢測方法對(duì)2 號(hào)高粱、3 號(hào)高粱中蜀黍苷進(jìn)行檢測，蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)樣MRM 色譜圖見圖5 和圖6，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)提取液中蜀黍苷含量進(jìn)行分析，并進(jìn)一步計(jì)算高粱中蜀黍苷含量，結(jié)果表明，2 號(hào)高粱和3 號(hào)高粱中蜀黍苷含量分別為1.73 mg/L 和2.39 mg/L。濃度為10.1 μg/L 的蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)樣品和2 號(hào)高粱的MRM 色譜圖如圖5、圖6所示。

表6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對(duì)高粱樣品的前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了探索和優(yōu)化，樣品經(jīng)機(jī)械粉碎和甲醇水溶液萃取，采用HPLC-MS/MS 測定蜀黍苷含量。依托HPLC-MS/MS 的準(zhǔn)確性和高靈敏度，高粱樣品粉粹后，經(jīng)95%甲醇水溶液提取，通過稀釋、C18色譜柱分離來降低基質(zhì)效應(yīng)，即可準(zhǔn)確分析出蜀黍苷含量。本文所建立的檢測方法具有前處理簡單、易操作、耗時(shí)短、靈敏度高、結(jié)果精準(zhǔn)的特點(diǎn)，適合大量高粱樣品中蜀黍苷含量的測定。