褪黑素增強(qiáng)紫杉醇對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的抑制作用

陳歡，朱佳斌，趙曉瑾，董傳江△，董自強(qiáng)△

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］，也是全球第十大最常見(jiàn)的癌癥。在2018年，全球估計(jì)有54.9萬(wàn)新發(fā)病例和20萬(wàn)死亡病例；膀胱癌在男性中的發(fā)病較女性更常見(jiàn)，其發(fā)病率和死亡率是女性的4 倍［2］。近20 年來(lái)，我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，居男性惡性腫瘤發(fā)病率第六位［3］，尋找治療膀胱癌的新靶點(diǎn)是目前臨床研究的重點(diǎn)。根治性膀胱切除術(shù)并輔以化療是目前治療膀胱癌的主要方法［4］。但是，對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的膀胱癌，患者的5 年生存率仍然很低［5-6］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是國(guó)際上繼阿霉素和含鉑類抗癌藥物之后的熱點(diǎn)抗腫瘤藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制增殖細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［7］。紫杉醇對(duì)膀胱腫瘤具有顯著的療效，是目前所知單藥治療膀胱腫瘤最好的化療藥物。褪黑素（melatonin，Mel）是脊椎動(dòng)物松果體的主要分泌產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠、情緒、繁殖等生理作用［8］。先前的研究表明，褪黑素具有抗增殖、抗炎和抗腫瘤的作用［9］。本研究旨在觀察褪黑素能否增強(qiáng)紫杉醇對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制，為褪黑素協(xié)同紫杉醇治療膀胱癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑與儀器 PTX（純度＞98%，購(gòu)自美國(guó)sigma 公司）溶解于DMSO 中，儲(chǔ)備液濃度500 μmol/L。Mel（純度＞98%，購(gòu)自百靈威）溶解于DMSO 中，儲(chǔ)備液濃度500 mmol/L。CCK-8 檢測(cè)試劑購(gòu)自Bimake 公司；環(huán)氧化物酶-2（COX-2）抗體、p-p65/p65 抗體、p-IκBα/IκBα 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B（NF-κB）熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自漢恒生物科技有限公司；Dual-Luciferase 檢 測(cè) 試 劑 盒 購(gòu) 自Promega 公 司；RNAiso Plus 和PrimeScriptTMRT-PCR Kit 購(gòu)自TaKaRa 公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；紫外分光光度儀購(gòu)自Thermo公司；高速低溫離心機(jī)、臺(tái)式常溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Peridn Elmer公司；Western blot儀器購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞株T24 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American typeculture collection，ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃含5%CO2（體積分?jǐn)?shù)）的培養(yǎng)箱中。使用添加有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清及100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待貼壁生長(zhǎng)至90%時(shí)使用胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24 腫瘤細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24 細(xì)胞，按6×104/mL 密度接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為調(diào)零孔，100 μL/孔。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組中分別加入含不同濃度褪黑素和（或）紫杉醇培養(yǎng)液，褪黑素終濃度為0.25、0.50、0.75和1 mmol/L，紫杉醇終濃度為5、10、25和50 nmol/L，對(duì)照組中加入不含任何干預(yù)劑的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，除去上清培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%CCK-8的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞的存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%。

1.4 藥物劑量及細(xì)胞分組 根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，紫杉醇（5 nmol/L）聯(lián)合褪黑素（0.75 mmol/L）處理T24 細(xì)胞48 h 后，其抑制率接近半數(shù)抑制濃度（IC50），其濃度將作為后面的實(shí)驗(yàn)濃度。T24細(xì)胞設(shè)對(duì)照組（DMSO處理）、褪黑素組、紫杉醇組、紫杉醇聯(lián)合褪黑素組。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24 細(xì)胞的克隆形成能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種1 500個(gè)細(xì)胞，在CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h后，更換為新鮮的含有不同濃度藥物的10%FBS 培養(yǎng)基。24 h 后，更換為新鮮的10%FBS 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。細(xì)胞經(jīng)固定液（冰醋酸∶甲醇∶去離子水=1∶1∶8）固定后，0.1%結(jié)晶紫染液染色。

1.6 RT-PCR檢測(cè)COX-2 mRNA水平 各組加藥48 h后，收集膀胱癌細(xì)胞，Trizol 法提取各樣本細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH 上游引物5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下 游 引 物5'-CATCACGC CACAGTTTCC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度382 bp；COX-2 上游引物5'-TCACAGGCTTCCATTGACCAG-3'， 下游引物 5'-CCGAGGCTTTTCTACCAGA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度189 bp。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃30 s；55 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。以COX-2/GAPDH比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組加藥48 h 后，收集膀胱癌細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBS 封閉2 h，加入COX-2（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）、p-p65（1∶500）、p65（1∶1 000）、p-IκBα（1∶500）、IκBα（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯色檢測(cè)。

1.8 Dual-Luciferase 報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB 啟動(dòng)子活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24 細(xì)胞，以3×105個(gè)接種于6 孔板中。次日，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓4 h后，向每孔加入質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合液（0.07 μg pRL-TK、1.5 μg pGL3-NF-κB 和3.75 μL LipoFiterTM轉(zhuǎn)染試劑），6 h 后，更換新鮮含有不同劑量藥物的培養(yǎng)基。24 h后，用Dual-Luciferase試劑盒檢測(cè)Luciferase熒光強(qiáng)度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析（ANOVA）或析因設(shè)計(jì)方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24 細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)和克隆形成的影響 單因素方差分析顯示，與對(duì)照組相比，褪黑素、紫杉醇單獨(dú)或者協(xié)同給藥處理對(duì)T24 膀胱癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用（P＜0.05），見(jiàn)圖1。紫杉醇單獨(dú)作用于T24 細(xì)胞48 h 的IC50為（19.5±2.7）nmol/L，紫杉醇聯(lián)合褪黑素（0.75 mmol/L）作用于T24細(xì)胞48 h的紫杉醇IC50為（6.8±1.2）nmol/L。褪黑素可以增強(qiáng)紫杉醇對(duì)T24 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，紫杉醇聯(lián)合褪黑素作用與紫杉醇單獨(dú)作用相比，褪黑素能夠明顯降低紫杉醇的IC50值。由此，選取0.75 mmol/L褪黑素和5 nmol/L紫杉醇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與紫杉醇或褪黑激素單獨(dú)處理組相比，紫杉醇聯(lián)合褪黑素組中T24 細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞形態(tài)變圓，變小，細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸、絲狀偽足均顯著減少，見(jiàn)圖2。析因方差分析顯示，與紫杉醇組相比，聯(lián)合治療組中T24 細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。褪黑素可顯著影響紫杉醇的治療效果，聯(lián)合褪黑素處理組細(xì)胞克隆形成率（8%）顯著低于紫杉醇單獨(dú)處理組（53.7%）。

2.2 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24 細(xì)胞COX-2 表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，紫杉醇組T24 細(xì)胞中COX-2的mRNA 和蛋白水平均明顯降低；與紫杉醇單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療組T24 細(xì)胞中COX-2 的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，見(jiàn)圖4。

Fig.1 Effects of melatonin combined with paclitaxel on the survival rate of T24 cells圖1 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24細(xì)胞存活率的影響

Fig.2 Effects of melatonin combined with paclitaxel on morphology of T24 cells(×25)圖2 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24細(xì)胞形態(tài)的影響（×25）

Fig.3 Effects of melatonin combined with paclitaxel on the cloning of T24 cells圖3 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24細(xì)胞克隆形成的影響

Fig.4 Effects of melatonin combined with paclitaxel on COX-2 expression in T24 cells圖4 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)T24細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響

2.3 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組和紫杉醇組比較，聯(lián)合治療組中pp65/p65 和p-IκBα/IκBα 的水平顯著降低；此外，與紫杉醇組比較，聯(lián)合治療組NF-κB啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性也顯著減低（P＜0.05），見(jiàn)圖5、6。

Fig.5 Effects of melatonin combined with paclitaxel on NF-κB signaling pathway圖5 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

Fig.6 Effects of melatonin combined with paclitaxel on transcriptional activity of NF-κB promoter圖6 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對(duì)NF-κB啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

3 討論

在膀胱癌的治療中，紫杉醇作為一種單藥治療膀胱腫瘤最好的化療藥物，在臨床上取得了一定的療效，但是其不良反應(yīng)較多。為了增強(qiáng)紫杉醇的治療效果，減輕藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)，改善患者的預(yù)后，臨床中常采用紫杉醇聯(lián)合其他藥物治療膀胱癌，如吉西他濱、順鉑等。褪黑素是一種衍生自L-色氨酸的吲哚胺，在生物體中普遍存在，包括人類。褪黑素具有廣泛的生理作用，包括促進(jìn)睡眠、晝夜節(jié)律、體溫調(diào)節(jié)、季節(jié)性繁殖、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等［10-11］。褪黑素能夠通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，包括膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌和白血病等［12-15］。許多研究證明，褪黑素是一種有效的抗癌藥物，并且成功用于不同類型癌癥的化療以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［13-14，16］。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素聯(lián)合不同濃度紫杉醇對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞的抑制作用顯著高于單獨(dú)使用紫杉醇，在褪黑素（0.75 mmol/L）的作用下，可以明顯降低紫杉醇的IC50值。

COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，與許多人類癌癥的發(fā)生有密切聯(lián)系，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，其過(guò)度表達(dá)與患者預(yù)后不良高度相關(guān)［17-18］。COX-2 的表達(dá)受經(jīng)典NF-κB 信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控［19-20］。COX-2 高表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞中，可通過(guò)不同途徑促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展［21-23］。因此，抑制COX-2 表達(dá)可能是抑制膀胱癌進(jìn)展的有效方法。本研究表明，褪黑素顯著增強(qiáng)紫杉醇抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，表現(xiàn)為降低pp65/p65 和p-IκBα/IκBα 的蛋白表達(dá)水平。此外，褪黑素可增強(qiáng)紫杉醇抑制NF-κB啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制COX-2 的表達(dá)，提示褪黑素增強(qiáng)T24 細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性的原因之一可能是褪黑素增強(qiáng)紫杉醇抑制NF-κB 信號(hào)通路的活性及其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究者給予裸鼠褪黑素25 mg/kg劑量時(shí)，可明顯增加5-氟尿嘧啶的敏感性［13，24］。按照藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［25］，成人（60 kg）褪黑素服用量為2 mg，符合美國(guó)食品藥品管理局（FDA）對(duì)于成人推薦劑量（1～3 mg）。紫杉醇用量為135～175 mg/m2，按照成人換算即45～66 μmol/L（體表面積為1.6 m2，血液量5.6 L）。因此，本研究中采用的劑量對(duì)人體的毒性在合理的范圍內(nèi)。

總之，本研究表明褪黑素增強(qiáng)了紫杉醇抑制膀胱癌生長(zhǎng)的能力，其機(jī)制為通過(guò)抑制NF-κB/COX-2信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)褪黑素增強(qiáng)紫杉醇對(duì)膀胱癌細(xì)胞抑制作用。同時(shí)，本研究中采用的劑量對(duì)人體的毒性在合理的范圍。這為今后褪黑素協(xié)同紫杉醇治療膀胱癌提供了理論依據(jù)。