Reg Ⅳ在不同分子分型乳腺癌中的表達及意義

宋姍姍，聶艷紅，張春芳，林海月，張強，陳昊△

乳腺癌作為一種高度異質性的惡性腫瘤，發病率逐年上升，現已躍居女性惡性腫瘤的首位［1］。2013年St Gallen乳腺癌會議國際共識［2］根據雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（HER-2）及增殖細胞核抗原（Ki-67）的表達，將乳腺癌分為腺腔A 型（LA）、腺腔B 型（LB）、HER-2 過表達型（HER-2+）和三陰性乳腺癌（TNBC）4 種亞型。乳腺癌不同分子分型的個體化治療已在臨床廣泛應用［3］，但TNBC 型對內分泌治療、HER-2 靶向治療均不敏感，對常規化療也不敏感，是目前唯一未建立特異性靶向治療的亞型，因此尋找特異性治療靶點是TNBC 研究的熱點［4］。再生胰島衍生家族成員（regenerating islet-derived family member，Reg）Ⅳ是從炎癥性腸病基因庫中篩選出的一種新的Reg家族亞型［5］。其主要在近端胃腸道表達，且異常表達于炎癥損傷及腫瘤組織中［6-7］，可誘導腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及抗凋亡等［8-9］。研究發現結直腸癌中Reg Ⅳ與表皮生長因子受體（EGFR）表達呈正相關，推測Reg Ⅳ是EGFR/Akt/AP-1 通路的上游因子［10-12］。由于TNBC 中亦有EGFR 相關信號通路的激活［13-14］，筆者推測Reg Ⅳ可能在TNBC 中發揮作用。鑒于此，本研究采用免疫組化染色、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和生物數據庫大數據分析Reg Ⅳ在乳腺癌和不同分子分型中的表達及意義，為乳腺癌的診斷、治療和臨床評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集徐州醫科大學附屬連云港第一人民醫院2017 年1 月—2019 年5 月的手術切除標本。患者均為女性，手術前未進行放化療，所有病例均由2位正高級病理醫師證實。乳腺癌組織共140 例，其中LA 型30 例，LB 型50 例（HER 陰性亞型和陽性亞型各25 例），HER2+型30 例，TNBC型30 例；正常乳腺組織75 例（距癌組織＞5 cm）作為對照。每例標本分別收集2 份，1 份標本于甲醛固定行免疫組化染色，另1份用于qRT-PCR。

1.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒及擴增試劑盒（南京諾唯贊公司）。GAPDH內參引物（江蘇凱基公司）；Reg Ⅳ引物上游：CTGCTCCTATTGCTGAGCTG，下游 : GGACTTGTGGTAA AACCATCCAG［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Reg Ⅳ一抗（美國Proteintech 公司），ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR一抗（廣州安必平公司）；過氧化物酶阻斷劑、三合一抗原修復液、二抗、DAB顯色液、PBS（美國DAKO公司）。

1.3 免疫組化染色檢測Reg Ⅳ蛋白的表達及結果判讀 采用EnVison 法。3.7%中性甲醛固定標本，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用免疫組化自動染色儀行免疫組化染色。以結腸癌作為陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照。Reg Ⅳ主要表達于細胞膜和（或）細胞質，根據陽性細胞百分比與染色強度進行綜合計分。（1）隨機讀取5～10 個高倍鏡視野（×400）計數陽性細胞百分比，無陽性細胞為0 分，1%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。（2）按照著色強弱計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。（3）陽性細胞百分比與染色強度評分的乘積進行綜合判斷：≤3分為陰性，＞3分為陽性。依據2012年美國臨床腫瘤學會（ASCO）的標準判讀ER、PR表達。依據2013 年ASCO/CAP 乳腺癌HER-2 檢 測指南判讀HER-2 表達，其中HER-2（2+）進一步行熒光原位雜交（FISH）檢測；對于EGFR的判讀，存在明顯的胞膜染色即視為陽性；Ki-67表達以20%為界，＜20%為低表達，≥20%為高表達。

1.4 qRT-PCR檢測Reg ⅣmRNA的表達 液氮研磨法提取總RNA，測其濃度及純度后逆轉錄為cDNA 并于-20 ℃保存備用。qRT-PCR 條件：預變性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40個循環；熔解曲線95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。每個樣本復孔3次，得到熔解曲線、標準曲線和樣本的Ct值，取2-ΔΔCt值進行相對表達量的比較。

1.5 生物數據庫分析Reg ⅣmRNA的表達與預后 Kaplan-Meier Plotter 公共數據庫（http://kmplot.com/analysis）收錄了10 461 個癌癥樣本信息，其中包含5 143 例乳腺癌患者生存資料和基因表達信息。本研究分析該數據庫內3 951例乳腺癌患者Reg ⅣmRNA 的表達水平與患者無復發生存期（RFS）、總生存期（OS）、無遠處復發生存期（DMFS）、復發后生存期（PPS）的關系。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料表達以均數±標準差（±s）表示，2 組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析利用Kaplan-Meier 中Log-rank模型。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Reg Ⅳ蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達 Reg Ⅳ主要位于細胞膜和（或）細胞質，呈棕黃色顆粒（圖1）。正常乳腺組織中Reg Ⅳ陽性表達率為25.33%（19/75），乳腺癌中陽性表達率為49.29%（69/140），其中LA 型53.55%（16/30）、LB 型52%（26/50）、HER-2+型66.67%（20/30）、TNBC 型23.33%（7/30）。Reg Ⅳ蛋白在乳腺癌中的陽性表達率明顯高于正常乳腺組織（χ2=11.589，P＜0.01），在非TNBC型（LA型、LB型及HER-2+型）乳腺癌中的陽性表達率明顯高于TNBC型（56.36%vs.23.33%，χ2=10.289，P＜0.01）。

2.2 RegⅣmRNA 在不同分子分型乳腺癌中的表達 qRT-PCR 結果顯示，正常乳腺組織中RegⅣmRNA 的表達水平為1.19±0.47，乳腺癌中表達水平為2.04±0.66，其中LA 型為2.14±0.49、LB 型為2.26±0.55、HER-2+型為2.36±0.53、TNBC 型為1.25±0.48。Reg ⅣmRNA在乳腺癌中的表達水平明顯高于正常乳腺組織（t=9.891，P＜0.01），正常乳腺組、非TNBC組和TNBC 組的Reg ⅣmRNA 表達水平差異有統計學 意 義（F=117.100，P＜0.01），其 中 非TNBC 組（2.25±0.53）高于TNBC 組和正常乳腺組，正常乳腺組與TNBC組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 Reg Ⅳ與乳腺癌相關標志物及臨床病理特征間的關系 ER+、PR+、HER-2+組中Reg ⅣmRNA表達水平明顯高于各自陰性表達組（P＜0.01），但EGFR陽性組和陰性組及Ki-67高表達和低表達組比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。40歲以上患者中RegⅣmRNA的表達水平高于40歲及以下患者；在腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者RegⅣmRNA水平分別高于直徑＞2 cm組和Ⅲ～Ⅳ期組；而在淋巴結是否轉移、不同組織學分級、不同側別組中Reg ⅣmRNA的表達差異無統計學意義，見表2。

2.4 Kaplan-Meier Plotter 數據庫中乳腺癌患者RegⅣmRNA 表達與預后的關系 Kaplan-Meier Plotter數據庫顯示乳腺癌患者Reg ⅣmRNA的表達與患者預后相關。Reg Ⅳ高表達患者RFS、OS、DMFS 和PPS較低表達者明顯延長，預后較好，見圖2。

Fig.1 Immunohistochemical staining of RegⅣin normal breast and breast cancer tissues(EnVision methord，×200)圖1 Reg Ⅳ在正常乳腺組織和乳腺癌中的表達（EnVision法，×200）

3 討論

盡管基于ER、PR和HER-2的個體化治療降低了患者的病死率，但乳腺癌患病基數大，且發病率呈逐年升高趨勢［15］。鑒于乳腺癌的分子分型對治療及預后評估的重要參考價值［16］，筆者從分子分型角度探討RegⅣ在乳腺癌中的表達及意義。不同于Oue等［17-18］的結果，本研究發現Reg Ⅳ在正常乳腺中的表達低于乳腺癌，可能是由于文獻中的組織學類型不同（研究對象僅為少量乳腺印戒細胞癌的患者），或文獻中樣本量較小導致。在乳腺癌4種分子分型中，Reg Ⅳ在非TNBC型乳腺癌中的表達明顯高于TNBC型，且正常乳腺組織與非TNBC型乳腺癌中差異明顯，與TNBC型無明顯差異，表明Reg Ⅳ可能與非TNBC型乳腺癌的發生發展有關。本研究結果亦表明，Reg Ⅳ與ER、PR、HER-2有關，這可能是Reg Ⅳ在不同分子分型中表達差異的根源。在卵巢癌的研究中亦發現，Reg Ⅳ可能參與腫瘤的形成，而卵巢癌的發生發展與雌激素、孕激素分泌異常有關［19-22］。筆者推測，Reg Ⅳ在腫瘤的發生發展中的作用可能和激素或激素受體有關。此外，有研究發現ER、PR陽性乳腺癌患者的預后一般較好［23］，對于HER-2+患者采取靶向治療亦可獲得較好的預后［24］。RegⅣ與分子分型、生物標志物的相關性可能為其診斷及治療提供幫助。Reg Ⅳ與EGFR無關，這與在結直腸癌中的研究不同［10］，可能是由于組織特異性，或者實驗誤差，抑或Reg Ⅳ的表達是由多個通路共同調控的。

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相關標志物與Reg ⅣmRNA表達的關系（±s）

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相關標志物與Reg ⅣmRNA表達的關系（±s）

＊＊P＜0.01

相關標志物ER n Reg ⅣmRNA t+-80 60 2.21±0.52 1.81±0.75 3.581＊＊images/BZ_77_410_793_412_794.pngPR+-62 78 2.22±0.58 1.89±0.69 3.120＊＊HER-2+-55 85 2.38±0.53 1.81±0.64 5.457＊＊Ki-67＜20%≥20%EGFR 46 94 2.13±0.63 1.99±0.67 1.208+-54 86 1.92±0.66 2.11±0.66 1.631

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同臨床病理特征間Reg ⅣmRNA表達水平的比較（±s）

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同臨床病理特征間Reg ⅣmRNA表達水平的比較（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與年齡≤40歲比較，P＜0.05

臨床病理特征年齡（歲）≤40 40～60＞60側別n Reg ⅣmRNA F或t 17 82 41 1.67±0.68 2.08±0.65a 2.11±0.64a 3.103＊＊左右67 73 1.96±0.65 2.10±0.66 1.266腫瘤直徑（cm）≤2＞2 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ淋巴結轉移陽性陰性組織學分級64 76 2.16±0.68 1.94±0.63 1.982＊110 30 2.10±0.66 1.81±0.60 2.179＊52 88 2.07±0.74 2.02±0.61 0.500 1 2 3 16 79 45 2.25±0.60 2.04±0.66 1.95±0.70 1.159

Fig.2 Prognostic significance of Reg ⅣmRNA expression in breast cancer圖2 Reg Ⅳ表達與乳腺癌的預后關系

本研究發現，40歲以上組Reg Ⅳ的表達高于40歲以下組。Zhong等［25］研究發現，年輕患者更易復發，預后更差。亦有研究發現，年輕患者ER、PR 陽性率更低，更傾向于預后差的TNBC 型［26］。Diab 等［27］也認為隨著年齡的增加，ER 表達逐漸增高。考慮Reg Ⅳ與ER、PR的關系，這可能解釋了Reg Ⅳ在高齡患者中表達較高，是預后較好的指標。本研究還發現，Reg Ⅳ高表達于腫瘤直徑更小、TNM 分期更低的患者中。Shui等［28］發現腫瘤直徑小的患者不易發生腋窩淋巴結轉移，預后較好。Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析發現Reg Ⅳ高表達與良好的生存結局相關。結合Reg Ⅳ與乳腺癌相關標志物、分子分型和臨床病理特征的關系，筆者認為，乳腺癌患者Reg Ⅳ表達水平越高，提示患者的預后越好。