低表達抑癌環狀RNA在胃癌診斷及預后中作用的Meta分析

劉云，張曼玲，彭洪嬌，時昭紅

胃癌是世界上嚴重的惡性腫瘤之一，在所有癌癥中其發病率及死亡率分別為第5 和第3 位［1］。但是，胃癌發病率和死亡率在世界范圍內的分布并不均勻［2］。所有胃癌病例中有一半以上發生在東亞、歐洲中東部和中南美洲，尤其在日本和中國有著較高的發病率。胃癌起病隱匿，往往發現時已經進入晚期，早期診斷及手術根治性切除可能性低，術后5年生存率不足25%［3］。盡管現在臨床上糖類抗原（CA）199、癌胚抗原（CEA）［4］、CA724［5］等腫瘤標志物已被廣泛使用，但是其特異度（SPE）及敏感度（SEN）均不理想，且無法預測預后［6］。目前急需一種新的分子生物標志物用于更好地診斷胃癌及判斷預后。

環狀RNA（circRNA）是一類特殊的內源性非編碼RNA，主要通過兩外顯子的套索環化或內含子的配對環化2種方式形成［7］。近年來，隨著高通量測序技術和實驗技術的發展和完善，有關circRNA 的研究不斷深入，發現其在腫瘤診斷及判斷預后方面有應用前景［8］。多個研究表明，circRNA 可以作為miRNA 的分子海綿，起到調控基因表達，調控增殖、遷移、侵襲等多種生物學過程的作用［9-10］。同時研究還發現，circRNAs 在胃癌患者腫瘤組織和血清樣本中表達失調，并與臨床病理結果相關，提示circRNAs可能是胃癌進展中的生物標志物［11-13］。鑒于目前缺乏對circRNA 在胃癌診療中的系統評價，本研究通過系統回顧和薈萃分析來評估低表達抑癌circRNA 與胃癌診斷及預后之間聯系，旨在闡明circRNA 作為診斷胃癌生物標志物及判斷預后的可能性，為臨床決策提供幫助。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 對PubMed、Embase、Web of Science 數據庫進行檢索，檢索2019年6月之前發表的文獻。檢索策略采用主題詞與自由詞相結合的方式，檢索式為：“circRNA”或“circular RNA”且“stomach neoplasm”或“gastric neoplasm”或“gnastric cancer”或“stomach cancer”或“GC”，篩 選 流 程見圖1。

1.2 納入與排除標準 文獻納入標準：（1）有關circRNA 低表達的病例對照研究或隊列研究。（2）患者被確診為胃癌。（3）文獻內容包括關于circRNA 的表達、基礎臨床病理參數、預后參數及診斷參數。排除標準：（1）數據重復發表。（2）動物實驗、會議摘要、病例報告及綜述。（3）無可提取數據。（4）非英語文獻。

1.3 數據提取 3名評閱人（劉云、張曼玲和彭洪驕）評估所有錄入文獻，并獨立對數據進行分析。此外，第4 名評閱人（時昭紅）在出現數據矛盾時解決分歧。數據提取內容：（1）納入研究的基本特征，包括第一作者、發表年份、發表國家、研究人群來源、circRNA 名稱、病例數、檢測方法。（2）從文中直接提取或運用Engauge Digitizer 4.1 軟件從生存曲線上獲取所需數據，通過計算獲得總生存期（OS）的風險比，用于預后分析。（3）在診斷分析中，收集敏感度、特異度和曲線下面積（AUC）。（4）臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴轉移等。

1.4 質量評價 文獻質量評價根據Newcastle-Ottawa Scale（NOS）進行評估，如果評分≥7 分研究被認為是高質量文獻。本研究符合系統審查和Meta分析（PRISMA）聲明的首選報告項目。

1.5 統計學方法 所有統計分析均使用Stata 14.0統計軟件進行。合并優勢比（OR）和95%置信區間（CI）用于評估臨床病理參數，敏感度、特異度，危險比（HR）用于評估OS。使用χ2檢驗和I2統計量評估研究之間的異質性。如果I2值＜50%，則認為不存在明顯的異質性。當存在明顯的異質性時，采用隨機效應模型，否則使用固定效應模型。在本研究中，采用隨機效應模型量化合并的敏感度、特異度、診斷優勢比（DOR）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）和AUC，并計算相應的95%CI。進一步進行敏感性分析，以檢測結果的穩定性和潛在的異質性來源。漏斗圖、Deeks’圖用于檢測發表偏倚。

Fig.1 Flowchart of the study selection process圖1 文獻篩選流程及結果

2 結果

2.1 文獻檢索流程及結果 本次研究在數據庫共檢索到314篇相關文獻，通過閱讀全文與摘要，依據本研究的納入和排除標準，最終篩選出20篇［14-33］合格文獻進行Meta 分析，其中7 篇文獻用于臨床病理特征分析，9篇文獻可用于預后分析，16篇文獻用于診斷分析，共計2 008例研究對象。

2.2 納入文獻的質量評價 采用NOS 評分標準評價納入文獻的方法學質量，該標準包括3 個方面的評價：病例組與對照組選擇方法、病例組與對照組的可比性以及接觸暴露評估方法。評價后得分越多質量越高，最高為10 分。20 篇文獻中7 篇文獻得分8分，10篇文獻得分7分，3篇文獻得分6分。

2.3 臨床病理參數Meta 分析 抑癌circRNA 表達水平降低與較差的臨床病理特征顯著相關（分化程度：OR=1.33，95%CI：1.14～1.55；TNM 分 期：OR=1.45，95%CI：1.24～1.70；淋巴轉移：OR=1.31，95%CI：1.14～1.48；腫瘤大?。篛R=1.28，95%CI：1.06～1.54）；而抑癌circRNA 表達水平降低與年齡（OR=0.99，95%CI：0.86～1.12）、性 別（OR=0.98，95%CI：0.89～1.08）無關。

2.4 預后Meta分析

2.4.1 預后Meta 分析文獻的基線特征 預后Meta分析共納入9 篇文獻，包括10 種circRNA，所有研究均在中國進行。發表時間從2017—2019 年。每項研究的樣本量為51～112。此外，均采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測circRNA 的表達水平，見表1。

Tab.1 The main characteristics of included studies for prognosis analysis表1 納入預后Meta分析文獻主要臨床數據

2.4.2 總生存率Meta 分析結果 通過匯總9 篇文獻［17-20,25，30-33］，10 項總生存率數據，各研究間無明顯異質性（I2=0，P=0.811），采用固定效應模型進行分析得出抑癌circRNA 高表達與較好的OS 顯著相關（HR=0.37，95%CI：0.29～0.48）。見圖2。

Fig.2 Forest plots for overall survival(OS)according to ow-expression of circRNAs圖2 低表達circRNA總生存期（OS）森林圖結果

Fig.3 The funnel plot of publication bias of included studies圖3 納入研究文獻的發表偏倚漏斗圖

2.4.3 預后Meta 分析納入文獻的發表偏倚和敏感性分析 對OS繪制漏斗圖評價發表偏倚，其結果顯示集中趨勢明顯，不存在發表偏倚，見圖3；采用敏感性分析檢測各項研究對合并HR 的影響，結果顯示合并后HR的結果穩定性良好，見圖4。

2.5 診斷Meta分析

2.5.1 診斷Meta 分析文獻的基線特征 診斷Meta分析研究的基線特征見表2。診斷Meta分析共納入16篇文獻，包括17種circRNA，所有研究均在中國進行，發表時間從2017—2019年。納入研究的樣本量40～254。均采用qRT-PCR 測量circRNA 的表達水平，試驗組的樣本均來自胃癌患者；對照組中，胃組織來源均為癌旁正常胃組織，此外對照組血清來源均來自正常人群。

2.5.2 診斷Meta 分析結果 通過匯總16 篇文獻［14-29］，21 項總診斷數據，匯總后的敏感度為0.73（95%CI：0.66～0.79；I2=90.67%），特 異 度 為0.77（95%CI：0.68～0.84；I2=92.69%），AUC 為 0.81（95%CI：0.77～0.84）；此外陽性似然比（PLR）為3.13（95%CI：2.32～4.22；I2=84.87%），陰性似然比（NLR）為0.36（95%CI：0.30～0.42；I2=91.74%），DOR 為8.75（95%CI：6.37～12.03；I2=100.0%），見圖5。由于各項匯總數據均存在明顯異質性，進一步用亞組分析來分析異質性來源，結果顯示血清circRNA 的診斷效能高于胃癌組織，見表3。

2.5.3 納入診斷Meta 分析文獻的發表偏倚 采用Deeks’漏斗圖對診斷分析各項研究進行不對稱檢驗，未發現發表偏倚（P=0.55），見圖6。

Fig.4 The sensitivity analysis of included studies圖4 納入研究文獻的敏感性分析圖

Tab.2 The main characteristics of included studies for diagnosis analysis表2 納入診斷Meta分析文獻主要臨床數據

3 討論

目前雖然胃癌的病死率已經逐步下降，但是卻對患者生活質量造成了極大的影響［34］，這主要是因為早期胃癌癥狀不顯著，常與其他胃腸疾病癥狀相似，因此延誤診治，從而使得大多數胃癌患者在診斷時已處于Ⅲ期或Ⅳ期末期階段，不可避免地要進行胃切除手術［35］。而內鏡檢查及病理檢查，雖然能及時發現早期胃癌，但由于其不可避免的侵入性及難以忍受的檢查過程，依然難以在臨床上廣泛開展。因此，迫切需要理想的非侵入性生物標志物來加強胃癌檢測。

目前，有關尋找新型腫瘤生物標志物的大量研究表明，胃癌患者和健康對照之間微小RNA（miRNA）表達水平有著明顯差異，提示miRNA 可能在癌癥抑制中起關鍵作用［36］。Wei 等［37］通過對48篇文獻進行薈萃分析后得出，血清miRNA對于診斷胃癌的敏感度、特異度以及AUC分別為0.76、0.81以及0.86。隨后長鏈非編碼RNA（LncRNA）的發現使研究重點發生轉移，相關研究發現LncRNA 不僅參與細胞生長、代謝和凋亡等正常的生理過程［38］，也在胃癌的發生、發展過程中發揮著重要的生物學作用，不僅能促進腫瘤血管生成［39］，還參與了胃癌的侵襲和轉移等過程［39］。Hu等［40］通過對10篇文獻進行薈萃分析發現，LncRNA 診斷胃癌的敏感度為0.63，特異度為0.75，AUC為0.76。

Fig.5 Forest plot of sensitivity and specificity of low-expression of circRNAs for the diagnosis圖5 低表達circRNA診斷分析敏感度、特異度森林圖

Fig.6 The Deeks’funnel plot of diagnosis of included studies圖6 納入研究文獻的診斷分析Deeks’漏斗圖

Tab.3 Results of subgroup diagnostic Meta-analysis of low-expression of circRNAs表3 低表達circRNA診斷Meta亞組分析

近年來circRNA 在癌癥中的重要作用得到了廣泛的認可。從2012 年至今，大量研究報道了circRNA 起源、結構和生物學功能以及其在細胞增殖、轉移和腫瘤復發中的作用［9］。同時，circRNAs作為胃癌生物標志物的研究明顯增加。Wang 等［41］初步對9 種circRNA 在胃癌中的診斷效能進行薈萃分析，敏感度、特異度以及AUC 分別為0.73、0.72 以及0.78。鑒于circRNA研究的不斷深入，以及上述Meta分析文獻數量的局限性，本研究共納入16 篇文獻，17 種circRNA 再次進行薈萃分析，探討了抑癌circRNA 作為胃癌診斷生物標志物的可行性。薈萃分析結果顯示：低表達抑癌circRNA 的診斷敏感度為0.73，特異度為0.77，AUC 為0.81，具有較理想的診斷效能，有望成為胃癌的診斷標志物；同時，筆者還進行了亞組分析，在胃癌組織中circRNA 敏感度為0.73，特異度為0.74，AUC 為0.79，而胃癌患者血清circRNA 敏感度為0.73，特異度為0.84，AUC 為0.85，提示與胃癌組織提取的circRNA 相比，血清circRNA 有著較高的診斷效能；同時，血清circRNA診斷效能接近血清miRNA，由于circRNA 為環形結構，與miRNA相比，不易被RNA酶降解，具有更好的穩定性，因此更易作為一種理想的胃癌檢測標志物。在各項研究中，circ_PSMC3 具有最佳的診斷效能，其敏感度為0.86，特異度為0.95，AUC 為0.93，并且circ_PSMC3 可通過血液檢查獲得，具有較好的臨床可操作性，可作為胃癌診斷標志物在更多的臨床試驗中進一步驗證。

晚期胃癌雖然經過手術治療，但仍然有40%～65%患者出現腫瘤遠處轉移和局部復發［42］，因此臨床上同樣需要更好的生物指標對術后患者預后做出判斷。本研究評估了抑癌circRNA作為胃癌生物預后標志物的意義。在臨床病理特征上，抑癌circRNA 的低表達與較差的臨床病理特征相關，如腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴轉移以及腫瘤大小。在預后價值方面，在研究中共對9 篇文獻，10 種circRNA 進行了薈萃分析，研究結果提示，低表達抑癌circRNA 的OS 僅為高表達抑癌circRNA 患者的37%。此外，本研究中circ_PVRL3［17］、circ_KIAA1244［18］、circ_PSMC3［19］、circ_0000467［20］、circ_0001017［25］、circ_0061276［25］可作為診斷和預后標志物，其中circ_0001017 不但預示著較差的總生存期（HR=0.29），還具有較好的診斷效能（敏感度=0.76，特異度=0.62，AUC=0.85），是具有臨床意義的胃癌標志物。

然而，本研究具有一些局限性：首先，由于circRNA 作為一種較新的非編碼RNA，目前所發表的文獻依舊不足；此外，同一種circRNA未被不同學者在多個研究中驗證，因此獲得的數據可能存在偏倚；在診斷薈萃分析中存在異質性，這可能是由于circRNA 檢測方法，樣本量大小，樣本病理特征不一等原因造成的，因此需要更詳細的數據進行亞組分析來解釋異質性來源；其次，納入的研究均為隊列研究及病例對照研究，文獻證據等級有著一定局限性；最后，本研究僅納入英文文獻，不能排除發表偏倚。

綜上所述，本研究從Meta 分析角度揭示了低表達抑癌circRNA與胃癌患者的臨床病理特征和預后之間的關系。低表達抑癌circRNA可作為一種有效的輔助診斷胃癌的生物標志物。本研究的結論仍需高質量的臨床試驗證實。