IRX5促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲遷移及其與miR-136-5p靶向關(guān)系的驗證

代龍光，朱麗英，2，沈婕，錢雯，張競之，朱金鳳，許永劼，劉歆蕾，許雯，朱科靜，張令，潘衛(wèi)，3，李興，4△

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，是全球第六大常見的腫瘤，也是全球癌癥死亡的第四大原因［1］。肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，約占原發(fā)性肝癌的80%［2］。研究顯示肝癌的5 年生存率不足20%，侵襲與轉(zhuǎn)移是肝癌重要的生物學(xué)特征，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是引起肝癌患者死亡的主要危險因素［3］。因此探索肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的發(fā)生機(jī)制是改善肝癌患者生存狀況的關(guān)鍵。miR-136-5p屬于非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游靶基因RAP2C［4］、MTDH［5］等的表達(dá)。有研究表明，miR-136-5p與胃癌［6］、肺鱗癌［7］等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是其在肝癌中的研究報道尚少見。易洛魁族同源盒基因5（Iroquois homeobox gene 5，IRX5）編碼蛋白屬于核轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)IRX5可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲和遷移［8］，敲低IRX5 表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞活力、增加細(xì)胞凋亡［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IRX5 在肝癌中高表達(dá)，運用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IRX5 可能為miR-136-5p 的靶基因［10］。本研究旨在進(jìn)一步探究IRX5 對肝癌細(xì)胞侵襲與遷移的影響，并且驗證miR-136-5p 與IRX5 是否存在靶向關(guān)系，為肝癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 293T 細(xì)胞和肝癌SMMC7721 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。空載質(zhì)粒（pcDNA3.1）、過表達(dá)IRX5 質(zhì)粒（pcDNA3.1-IRX5）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；敲低IRX5 質(zhì)粒（sh-IRX5）、陰性對照質(zhì)粒（sh-NC）由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點實驗室提供；pGL3-Control載體由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒試劑盒購自廣州美基公司；高保真酶PrimeSTAR?HS、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、T4 DNA 連接酶購自大連TaKaRa公司；脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司；DualGlo?Luciferase Assay System 購自美國Promega公司；DMEM、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自以色列BI公司；Transwell小室購自美國Corning公司；結(jié)晶紫購自碧云天技術(shù)有限公司。兔源IRX5 抗體（Abcam公司，英國），鼠源GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國），山羊抗鼠二抗（Affinity公司，美國），山羊抗兔二抗（Bioworld公司，中國）。倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本），DNA 電泳儀（北京六一生物科技有限公司，中國），PCR 儀（ABI公司，美國），多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 293T 細(xì)胞和肝癌SMMC7721 細(xì)胞采用10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期肝癌SMMC7721 細(xì)胞，按1×106個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過表達(dá)IRX5 實驗設(shè)2 組：空載質(zhì)粒（pcDNA3.1）組和過表達(dá)IRX5（pcDNA3.1-IRX5）組；敲低IRX5實驗設(shè)陰性對照（sh-NC）組和敲低IRX5（sh-IRX5）組；48 h 后觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，并拍照。

1.2.2 Western blot 檢測IRX5 的轉(zhuǎn)染效率 肝癌SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 分離目的蛋白并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉2 h。將PVDF 膜置于一抗GAPDH（1∶2 000）、IRX5（1∶500）中4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，將膜置于羊抗鼠二抗（1∶4 000）、羊抗兔二抗（1∶10 000）中室溫孵育2 h，ECL顯影并用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，Image J軟件分析灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.3 劃痕實驗 將轉(zhuǎn)染后的肝癌SMMC7721細(xì)胞接種到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%時，用200 μL的吸頭劃線，PBS清洗后加入無血清培養(yǎng)基，劃痕0 h、48 h時拍照。Image J軟件測定劃痕面積，計算細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell實驗 （1）遷移實驗參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。在Transwell 上室加入100 μL 無血清培養(yǎng)基，將600 μL 的完全培養(yǎng)基加入Transwell 下室中，將肝癌SMMC7721 細(xì)胞按4×104個/孔加入到上室中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛室溫固定15 min，清洗小室并風(fēng)干，1%結(jié)晶紫染色15 min，再次清洗、風(fēng)干后顯微鏡下拍照，并計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。（2）侵襲實驗。將100 μL Matrigel 基質(zhì)膠加入Transwell 上室中，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。在下室中加入100 μL 完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，后續(xù)鋪板、固定、染色操作與遷移實驗相同。

1.2.5 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA 和結(jié)合位點 采用miRNA 靶基因預(yù)測軟件miRanda（http：//www.microrna.org）和Targetscan（http：//www.targetscan.org）預(yù)測可能與IRX5 結(jié)合的miRNA及位點。

1.2.6 野生型和突變型IRX5 3'UTR雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 野生型質(zhì)粒pGL3-IRX5-3'UTR構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)［11］，采用SMMC7721細(xì)胞基因組DNA為模板，IRX5-3'UTR引物上游5'-GCTCTAGATAGATGGCCTTGGCAGTTATTTTTCC-3'，下游5'-GCTCTAGAAGAGACCAAGGCAATGGACAGTTTAT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增；50 μL反應(yīng)體系：2×PrimeSTAR HS（Premix）25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、基因組DNA模板2 μL、ddH2O 21 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。然后進(jìn)行DNA凝膠電泳，按DNA Marker的指示切取目的片段，并進(jìn)行膠回收、純化。采用XbaⅠ酶切IRX5-3'UTR、pGL3-Control載體，用T4 DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行涂平板。挑取陽性克隆至液體LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒，酶切后瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定；質(zhì)粒DNA堿基測序委托上海生工公司完成。突變型質(zhì)粒（pGL3-IRX5-3'UTRMut）委托武漢金開瑞公司合成。

1.2.7 雙熒光素酶實驗分組及結(jié)果測定 取對數(shù)生長期293T 細(xì)胞以5 000 個/孔接種于96 孔板，進(jìn)行雙熒光素酶實驗。根據(jù)雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的不同進(jìn)行分組，設(shè)野生型質(zhì)粒+陰性對照（IRX5-3'UTR-Wt+NC）組和野生型質(zhì)粒+miR-136-5p（IRX5-3'UTR-Wt+miR-136-5p）組；突變型質(zhì)粒+陰性對照（IRX5-3'UTR-Mut+NC）組和突變型質(zhì)粒+miR-136-5p（IRX5-3'UTR-Mut+miR-136-5p）組。按野生型質(zhì)粒或突變型質(zhì)粒200 ng/孔，NC 或miR-136-5p 200 nmol/L 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后檢測熒光素酶活性，步驟如下：每孔中加入100 μL 1×PLB 置于搖床上裂解15 min，取澄清的細(xì)胞裂解產(chǎn)物10 μL 加入EP 管中，緩慢吹打2～3 次，立即讀取熒光素酶活性值；然后加入50 μL 終止液，緩慢吹打4～5 次，立即讀取海腎熒光素酶活性結(jié)果。計算各組熒光素與海腎熒光素的相對活性值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IRX5轉(zhuǎn)染效率的驗證 轉(zhuǎn)染48 h后，觀察表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞達(dá)85%以上，見圖1。過表達(dá)IRX5 組IRX5 蛋白表達(dá)水平明顯高于空載質(zhì)粒組（n=3，t=4.041，P＜0.05）；敲低IRX5 組IRX5 蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對照組（n=3，t=5.716，P＜0.01），見圖2。

Fig.1 Expression of green fluorescent protein 48 h after transfection(×40)圖1 轉(zhuǎn)染48 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況（×40）

Fig.2 The expressions of IRX5 proteins detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測IRX5蛋白的表達(dá)變化

2.2 IRX5 對肝癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，劃痕48 h 后，過表達(dá)IRX5 組肝癌細(xì)胞遷移率高于空載質(zhì)粒組（P＜0.01）；敲低IRX5組肝癌細(xì)胞遷移率低于陰性對照組（P＜0.01）。Transwell實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)IRX5組肝癌細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均明顯高于空載質(zhì)粒組（均P＜0.01）；敲低IRX5 組肝癌細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均明顯低于陰性對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表1、2，圖3。

2.3 IRX5 結(jié)合miRNA 和結(jié)合位點的預(yù)測 通過miRanda、Targetscan 軟件預(yù)測，miR-136-5p 與IRX5匹配累計權(quán)重得分為-0.15，匹配度較高；并進(jìn)一步預(yù)測，IRX5 與miR-136-5p 存在1 個潛在的結(jié)合位點，見圖4。

Tab.1 Effects of overexpression IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表1 過表達(dá)IRX5對SMMC7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

Tab.1 Effects of overexpression IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表1 過表達(dá)IRX5對SMMC7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

＊＊P＜0.01

組別空載質(zhì)粒組過表達(dá)IRX5組t n 3 3細(xì)胞遷移率（%）58.58±1.66 82.00±1.99 15.662＊＊Transwell細(xì)胞遷移數(shù)（個）103.00±12.29 146.70±9.01 4.962＊＊Transwell細(xì)胞侵襲數(shù)（個）94.33±3.21 140.33±7.57 9.690＊＊

Tab.2 Effects of knockdown IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表2 敲低IRX5對SMMC7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

Tab.2 Effects of knockdown IRX5 on migration and invasion of SMMC7721 cells表2 敲低IRX5對SMMC7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照組敲低IRX5組t n 3 3細(xì)胞遷移率（%）58.89±0.47 40.66±1.71 17.776＊＊Transwell細(xì)胞遷移數(shù)（個）100.00±17.32 48.00±9.85 4.520＊Transwell細(xì)胞侵襲數(shù)（個）96.33±4.04 45.00±6.08 12.175＊＊

Fig.3 The results of Transwell assay(crystal violet,×200)圖3 Transwell實驗結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.4 Target sites and mutation sites for IRX5 bind to miR-136-5p圖4 miR-136-5p與IRX5結(jié)合的靶位點及突變位點

2.4 雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以SMMC7721 細(xì)胞基因組DNA 為模板，運用設(shè)計的IRX5-3'UTR 引物擴(kuò)增目的片段，電泳結(jié)果顯示，1、6、7、8、9 號樣本在564 bp 處有明顯的擴(kuò)增條帶，與目標(biāo)片段大小一致，見圖5。將重組的野生型pGL3-IRX5-3'UTR雙熒光素酶質(zhì)粒用XbaⅠ進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果顯示1、2、3、5 號為酶切陽性結(jié)果，酶切后存在2 個片段，分別位于564 bp 和6 000 bp 左右，與預(yù)期一致，進(jìn)一步驗證IRX5-3'UTR 片段與pGL3-Control 載體連接成功，見圖6。IRX5-3'UTR 野生型質(zhì)粒測序結(jié)果表明，測序序列與構(gòu)建片段序列結(jié)果一致，結(jié)合位點位于126～132 bp，見圖7。IRX5-3'UTR 突變質(zhì)粒反向測序結(jié)果顯示，測序序列與構(gòu)建突變片段序列結(jié)果一致，其中突變堿基位于508～514 bp，見圖8。

Fig.5 The amplification products of 5 IRX5-3'UTR圖5 IRX5-3'UTR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.6 The enzyme cutting identification result of PGL3-IRX5-3'UTR plasmid圖6 PGL3-IRX5-3'UTR質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

Fig.7 PGL3-IRX5-3'UTR wild-type plasmid sequencing results圖7 PGL3-IRX5-3'UTR野生型質(zhì)粒測序結(jié)果

Fig.8 PGL3-IRX5-3'UTR mutant plasmid sequencing results圖8 PGL3-IRX5-3'UTR突變型質(zhì)粒測序結(jié)果

2.5 雙熒光素酶實驗結(jié)果 雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，IRX5-3'UTR-Wt+miR-136-5p 組雙熒光素酶活 性 明 顯 低 于IRX5-3'UTR-Wt+NC 組（n=3，t=40.880，P＜0.01）；IRX5-3'UTR-Mut+miR-136-5p組雙熒光素酶活性與IRX5-3'UTR-Mut+NC 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=0.020，P＞0.05），見圖9。

Fig.9 Results of luciferase activity in four groups圖9 各組雙熒光素酶活性結(jié)果

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、降解細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移能力，最終導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵因素［12］。IRX5在前列腺癌［9］、舌鱗狀細(xì)胞癌［8］、結(jié)直腸癌［13］等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，提示IRX5與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Zhu 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，IRX5 的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者總生存率呈負(fù)相關(guān)。Myrthue 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，IRX5可通過下調(diào)p53的表達(dá)而抑制前列腺癌細(xì)胞的凋亡。Huang 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，舌鱗狀細(xì)胞癌中IRX5表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移。然而王亞玲［14］研究發(fā)現(xiàn)，IRX5在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達(dá)水平降低，且過表達(dá)IRX5 可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移。目前IRX5 在肝癌中的研究報道尚少見。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)IRX5可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移，敲低IRX5表達(dá)則抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移，提示IRX5在肝癌中發(fā)揮促癌作用。

有研究表明，miRNA在腫瘤中以miRNA-mRNA模式參與腫瘤的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、新生血管的形成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過程［15］。Han 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在三陰型乳腺癌中，miR-136-5p 通過與MTDH靶向結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與遷移，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展。Li等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，miR-136-5p通過靶向結(jié)合Bcl-2和Wnt2，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-136-5p 可以抑制腫瘤的進(jìn)展。Dong 等［17］研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中miR-136-5p表達(dá)下調(diào)，且通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IRX5是miR-136-5p 的下游靶基因之一，提示miR-136-5p 可能通過IRX5 發(fā)揮抑癌作用。本研究構(gòu)建了野生型和突變型IRX5 3'UTR 雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，并采用雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)miR-136-5p能夠降低野生型IRX5-3'UTR 的熒光素酶活性，對突變型IRX5-3'UTR 的熒光素酶活性無明顯影響，證實IRX5 是miR-136-5p 的 靶 基 因，miR-136-5p 通 過IRX5發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，IRX5能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移，生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實驗證實了IRX5與miR-136-5p之間的靶向關(guān)系，這為明確肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的發(fā)生機(jī)制提供了新的實驗基礎(chǔ)，也為肝癌的臨床治療提供了新的方向。