EBF1-shRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響

王琳，李丁，秦婷婷，任麗

近年來，肺癌發(fā)病率逐年上升，5年生存率僅為15%［1］；其中約85%是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），而肺腺癌是女性和非吸煙者NSCLC的常見類型［2］。肺腺癌的控制已成為全世界廣泛關(guān)注的問題，研究肺腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移對(duì)改善肺腺癌患者預(yù)后具有積極意義，但至今仍缺乏針對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移更有效的治療方法［3-4］。已有研究證實(shí)，腫瘤的形成往往是由基因突變引起，包括癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活或缺失［5］。研究顯示，肺腺癌通常缺失INK4a/ARF 位點(diǎn)，其編碼2 種抑制蛋白p16INK4a和p14ARF，是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDK）抑制劑，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中早期B 細(xì)胞因子1（EBF1）表達(dá)缺失或功能缺陷與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)［7-8］。本研究通過抑制肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)EBF1基因，對(duì)可能影響肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑儀器 SPF級(jí)雌性Balb/c Nu/Nu裸鼠8 只，體質(zhì)量18～20 g，6～8 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠中，恒溫恒濕，喂飼滅菌裸鼠飼料，飲用雙蒸水。肺癌組織及癌旁組織芯片（上海芯超公司）。Laemmli Sample Buffer（美國BIO-RAD 公司）；EBF1一抗（羊抗鼠及兔抗人，美國Sigma公司）；CDK6一抗（兔抗人）、P21一抗（兔抗人）、P27 一抗（兔抗人）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；GAPDH 一抗（鼠抗人）、β-actin 一抗（鼠抗人）購自美國BD Biosciences 公司；Western blot二抗（北京碧云天公司）；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，BrdU試劑盒（美國Roche公司）。pSUPE-Pretro-Nea-EBF1 及自由序列購自Sigma，逆轉(zhuǎn)錄及PCR 試劑盒購自Thermo。超微量分光光度計(jì)Nanodrop2000（美國Thermo 公司）；酶標(biāo)儀BioTel Synergy H2（美國BioTek公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測EBF1 在肺癌及癌旁組織中的表達(dá) 組織芯片室溫梯度乙醇脫蠟、水化，檸檬酸鈉熱抗原修復(fù)后滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源酶活性，10%山羊血清封閉30 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，0.5%氨水反藍(lán)后梯度乙醇脫水，涼干后滴加中性樹膠封片。以出現(xiàn)明顯棕色或黃色顆粒為陽性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肺腺癌細(xì)胞系：A549、H441；小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系：H209、H1155；正常對(duì)照細(xì)胞系：正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE及正常肺上皮細(xì)胞系Beas-2B，上述細(xì)胞均購自ATCC。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSUPE-Rretro-Neo-EBF1 和自由序列分別作為實(shí)驗(yàn)組（shRNA-EBF1組）及對(duì)照組（shRNA-control組）。

1.2.3 PCR 檢測EBF1在各細(xì)胞系中的表達(dá) 提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA單鏈。以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參基因，PCR檢測EBF1的表達(dá)。引物序列：EBF1上游5'-AAAGCATCCAACGGAGTGGA -3'，下游 5' -TTCCA ATCTGCGGAAATTCCA-3'，擴(kuò)增片段長度562 bp。PCR擴(kuò)增條件：50 ℃2 min；95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，36個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5%溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳中分離。

1.2.4 Western blot 檢測A549 細(xì)胞EBF1、CDK6、P21、P27 表達(dá) 將轉(zhuǎn)染48 h的A549細(xì)胞用預(yù)冷的含有5%β-巰基乙醇的蛋白提取緩沖液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中提取細(xì)胞總蛋白，超微量分光光度計(jì)測定蛋白濃度，取50 μg蛋白在SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌，滴加一抗羊抗鼠及人EBF1（1∶200）、兔抗人CDK6（1∶200）、兔抗人P21（1∶500）、兔抗人P27（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗兔抗羊（1∶2 000）、羊抗兔（1∶1 000）孵育后，ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影，Image J軟件分析灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。EBF1表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參，CDK6、P21、P27表達(dá)水平以β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 MTT法檢測A549細(xì)胞及H441細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×103個(gè)/孔，接種于96孔板中，培養(yǎng)基總量為200 μL，每組細(xì)胞設(shè)15個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁每組取3孔細(xì)胞，加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h后終止實(shí)驗(yàn)，利用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處的光密度（OD）值。每24 h檢測1次，連續(xù)測5 d，繪制生長曲線，以對(duì)照組生長曲線作為參考，比較實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長情況。

1.2.6 BrdU 實(shí)驗(yàn)檢測A549 及H441 細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×103個(gè)/孔，接種于96孔板中，每孔含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL，5%CO2，37 ℃孵育過夜，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入10 μmol BrdU（10 μL/孔），37 ℃孵育過夜，輕拍96孔板棄去上清，使用Cell Proliferation ELISA，BrdU 試劑盒加入FixDenat（bottle2）200 μL/孔，室溫孵育30 min，輕拍96孔板棄去上清，加入100 μL/孔BrdU 抗體室溫孵育90 min，輕拍96 孔板棄去上清，加入200 μL/孔洗液，輕拍96 孔板棄去上清，加入100 μL/孔顯色底物，30 min 內(nèi)酶標(biāo)儀在450 nm及690 nm處測量各孔的OD值，去除本底，計(jì)算ΔOD=OD450-OD690，以此代表細(xì)胞增殖過程中BrdU摻入量，即表明細(xì)胞增殖能力。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測A549 細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染shRNA-EBF1 及shRNA-control 的A549 細(xì)胞分別接種于6 孔板，待細(xì)胞約70%融合時(shí)，用200 μL加樣槍槍頭在培養(yǎng)皿上劃痕，PBS沖洗3遍，分別于劃痕時(shí)及培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)劃痕線拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h 邊緣距離-24 h 時(shí)邊緣距離）/0 h邊緣距離×100%。

1.2.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel 膠用RPMI 1640 培養(yǎng)基以1∶20 稀釋，在Transwell 小室中加入100 μL，37 ℃孵育4 h。用不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整A549細(xì)胞濃度為5×104/mL，取200 μL細(xì)胞鋪于上室，下室中加入500 μL含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS沖洗3遍，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，加入0.5%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 沖洗，棉簽輕輕擦去表面細(xì)胞。隨機(jī)拍照5個(gè)視野，并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 8 只裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組各4 只，分別皮下注射A549-shRNA-EBF1 及A549-shRNA-control。將2組細(xì)胞分別胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL。按無菌操作要求，每只裸鼠單側(cè)腋窩皮下注射細(xì)胞懸液200 μL（1×107個(gè)細(xì)胞），4周后取出皮下腫瘤，拍照并稱質(zhì)量，同時(shí)采用Western blot 和免疫組化染色檢測瘤體內(nèi)EBF1的表達(dá)。

1.2.10 細(xì)胞周期測定 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞1×106個(gè)，用預(yù)冷75%乙醇于4 ℃固定過夜，1 500 r/min離心5 min，棄上清，以3 mL的PBS洗滌3次，加入400 μL溴化乙錠（PI，50 mg/L），100 μL RNase A（100 mg/L），4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計(jì)算各種細(xì)胞中G0/G1期、S期及G2期細(xì)胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較用2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBF1在肺癌組織中的表達(dá)情況 EBF1在癌旁正常肺組織及肺癌組織的基質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)，但在非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)，并且EBF1主要表達(dá)于肺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，見圖1。

2.2EBF1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和H441 及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H209 和H1155 中均檢測到EBF1基因表達(dá)，正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE及正常肺上皮細(xì)胞系Beas-2B內(nèi)未見EBF1表達(dá)，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染EBF1特異性shRNA抑制肺腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖 Western blot 結(jié)果顯示，shRNA-EBF1組較shRNA-control 組EBF1 蛋白表達(dá)量降低，見圖3、表1。BrdU 實(shí)驗(yàn)顯示shRNA-EBF1 處理后A549及H441細(xì)胞的增殖水平較shRNA-control明顯降低（P＜0.05），見表1。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第3天開始，轉(zhuǎn)染shRNA-EBF1 的A549 和H441 細(xì)胞增殖能力明顯減弱，見圖4。小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與shRNA-control 組相比，shRNA-EBF1組細(xì)胞形成的腫瘤平均質(zhì)量明顯降低，見表1、圖5；且shRNAEBF1組腫瘤內(nèi)EBF1表達(dá)明顯下降，見圖6。

2.4 轉(zhuǎn)染EBF1特異性shRNA抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，shRNA-EBF1 組細(xì)胞鋪片24 h 后遷移能力較shRNA-control 組細(xì)胞緩慢（P＜0.01），見圖7、表2。侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，shRNAEBF1組細(xì)胞侵襲能力較shRNA-control 組明顯下降（P＜0.01），見圖8、表2。

Fig.1 The expression of EBF1 in lung cancer and peripheral lung tissues（Immunohistochemical staining，×400）圖1 EBF1在癌旁組織及肺癌組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

Fig.2 The expression of EBF1 in lung cancer cell lines圖2 EBF1在肺癌細(xì)胞系中表達(dá)情況

Fig.3 EBF1 specific shRNA down-regulated its expression in A549 cells圖3 EBF1特異性shRNA下調(diào)其在A549表達(dá)情況

Tab.1 Comparison of EBF1 protein,cell proliferation level and ability of tumorigenicity between A549-shRNA-EBF1 group and shRNA-control group表1 shRNA-EBF1組和shRNA-control組細(xì)胞EBF1蛋白、細(xì)胞增殖水平及小鼠成瘤能力比較

Fig.4 Effects of EBF1 knockdown on cell growth curves圖4 下調(diào)EBF1后對(duì)細(xì)胞生長曲線的影響

2.5 EBF1-shRNA阻滯A549細(xì)胞周期于G1期 與shRNA-control 組相比，shRNA-EBF1 組G0/G1 期細(xì)胞比例明顯增加，而S 期細(xì)胞比例降低（P＜0.01），見表3。

2.6 EBF1-shRNA 下調(diào)A549 細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CDK6的表達(dá) 與shRNA-control組相比，shRNAEBF1 組周期蛋白依賴激酶CDK6 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)伴有P21、P27表達(dá)增高（P＜0.01），見圖9、表4。

Fig.5 Effects of EBF1 knockdown on the tumorigenicity of in mice圖5 下調(diào)EBF1對(duì)小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

3 討論

3.1EBF1基因研究現(xiàn)狀EBF1基因位于人染色體5q34，是B細(xì)胞發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子，在B細(xì)胞分化和成熟中起著重要作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中，EBF1表達(dá)缺失，在兒童高危B 前體淋巴細(xì)胞白血病（ALL）中，EBF1缺失的頻率更高［10-11］。尤其是EBF1-PDGFRB融合基因使癌細(xì)胞分化停滯在前B 細(xì)胞階段（由于EBF1 功能缺陷）和持續(xù)增殖階段（由于PDGFRB 激酶活性紊亂）［8］。Stone等［12］發(fā)現(xiàn)，EBF1和雌激素受體1（ESR1）與乳腺癌易感性增加有關(guān)。可以推測，EBF1在實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用，但其作用的分子機(jī)制，特別是對(duì)肺癌的影響，目前尚不清楚。

3.2EBF1對(duì)肺腺癌A549 細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制 細(xì)胞周期可分為4 個(gè)階段：G1、S、G2 和M，它們與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制具有重要意義。細(xì)胞周期進(jìn)展受許多因素調(diào)節(jié)，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、CDK、CDK 抑制劑［13］。癌基因或抑癌基因與90%以上人類腫瘤中的細(xì)胞周期變化有關(guān)。其中，與G1期相關(guān)的基因變化頻率較高［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在A549 細(xì)胞中下調(diào)EBF1基因的表達(dá)能夠抑制其體內(nèi)外增殖，并且抑制A549細(xì)胞遷移及侵襲能力。一般而言，細(xì)胞生長抑制可能是由于細(xì)胞壞死、凋亡或者細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，EBF1-shRNA 抑制A549細(xì)胞的增殖能力是通過將細(xì)胞阻滯在G1期引起的，而細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，表明EBF1-shRNA 通過下調(diào)EBF1在A549細(xì)胞中的表達(dá)，將A549細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制其在體內(nèi)外的增殖能力。

Fig.6 Expressions of EBF1 in tumorigenesis of mice after EBF1 knockdown(Immunohistochemical staining，×200)圖6 下調(diào)EBF1后小鼠體內(nèi)成瘤中EBF1表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

Fig.7 Effects of EBF1 knockdown on the migration of A549 cells圖7 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.8 Effects of EBF1 knockdown on the invasion of A549 cells(crystal violet staining，×200)圖8 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，±s）

Tab.2 Effects of down-regulating EBF1 on the migration and invasion ability of A549 cells表2 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shRNA-control組shRNA-EBF1組t細(xì)胞遷移率（%）68.40±7.48 23.60±0.92 5.941＊＊穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）92.33±13.30 34.67±4.33 7.140＊＊

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（n=3，±s）

Tab.3 Effects of down-regulating EBF1 on the cell cycle of A549 cells表3 下調(diào)EBF1對(duì)A549細(xì)胞周期的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shRNA-control組shRNA-EBF1組t G0/G1期（%）33.58±1.41 42.06±0.99 4.914＊＊S期（%）49.49±0.83 39.23±0.79 9.005＊＊G2期（%）14.74±0.89 15.49±0.50 0.736

Fig.9 Effects of EBF1 knockdown on cell cycle regulation related proteins圖9 下調(diào)EBF1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的影響

Tab.4 The expression levels of CDK6,P21 and P27 after EBF1 knockdown in A549 cells表4 A549 細(xì)胞中下調(diào)EBF1后CDK6、P21及P27表達(dá)水平的影響

細(xì)胞周期蛋白表達(dá)豐度的改變可導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖甚至腫瘤［15］，其中在G1 期起作用的P21、P27蛋白最具代表性［16-17］。相關(guān)研究表明，P21及P27 蛋白表達(dá)的減少將導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖［18-19］。因此，為了進(jìn)一步探討沉默EBF1基因的表達(dá)抑制A549 細(xì)胞增殖的機(jī)制，筆者首先檢測了P21、P27 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)shRNA- EBF1 組P21、P27蛋白表達(dá)上調(diào)。Kollmann 等［20］在研究淋巴瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，在p16INK4a缺失下，CDK6通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)增殖和刺激血管生成并起到促進(jìn)腫瘤生長的功能。因此，筆者應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測了細(xì)胞中CDK6 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)shRNA- EBF1 組CDK6蛋白表達(dá)下調(diào)。當(dāng)然，EBF1調(diào)控A549細(xì)胞增殖過程中是否也通過調(diào)控VEGF影響血管生成還需要以后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

綜上所述，沉默EBF1基因的表達(dá)可將A549 細(xì)胞阻滯在G1 期而影響其增殖能力，同時(shí)伴有P21/P27表達(dá)水平的增高和CDK6蛋白表達(dá)下降，但這還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。