依那普利對自發性高血壓大鼠腎組織AngⅡ和TGF-β/Smads變化及腎纖維化的影響

陳萬里，李慧慧，朱振宇，黃安安，柳占彪，齊新

高血壓已成為當今社會嚴重損害人類健康的常見病［1］，是引發各種心腦血管疾病的重要危險因素。長期的高血壓會對心臟、腎臟等靶器官造成損傷［2］。研究表明，高血壓引起的腎損害已經是終末期腎病（ESRD）的第二大病因，僅次于糖尿病，且高血壓會引起腎臟的纖維化［3］。腎臟纖維化是許多慢性腎臟疾病發展到ESRD 的共同途徑和重要病理基礎［4］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）是神經-體液調節機制的重要環節，其激活可引起血管收縮、水鈉潴留，在高血壓的發病中有重要作用，其中血管緊張素（Ang）Ⅱ是RAAS 中最重要的效應分子［5］。目前研究表明RAAS有2個主要軸：經典的血管收縮軸［腎素-血管緊張素轉換酶（ACE）/AngⅡ/AngⅡ1 型受體（AT1R）軸］和血管舒張軸［ACE2/Ang（1-7）/Mas受體（MasR）軸］，它們在血管控制方面起相反作用；其中血管舒張軸對經典軸有拮抗作用，能在一定程度上延緩腎纖維化的進展［6］。目前的研究主要集中在RAAS 的血管收縮軸。AngⅡ有調節血壓和促進纖維化的作用，其促纖維化作用可能與轉化生長因子（TGF）-β/Smads 這一經典的信號通路有關［3］。血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）是臨床上常用的以RAAS為靶點的抗高血壓藥物，主要通過抑制AngⅠ轉化為AngⅡ進行降壓。有研究發現，ACEI 類藥物除可以有效降壓外，還可以改善高血壓引起的靶器官損害［7］。依那普利作為臨床上常用的ACEI 類藥物，降壓效果良好，但在改善腎功能方面的研究較少。本研究主要探討依那普利對自發性高血壓大鼠（SHR）的降壓效果，延緩腎纖維化作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 13周齡雄性SHR、雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。所有動物均飼養于天津市人民醫院動物房，適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 試劑及儀器 馬來酸依那普利片（10 mg，揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，國藥準字H32026567）。血尿素氮（BUN）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。AngⅡ、血清胱抑素C（CysC）、尿微量白蛋白（mALB）試劑盒購自天津安諾瑞康生物技術有限公司。TRNzol 總RNA 提取試劑盒、FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal 熒光定量預混試劑（增強版）均購自北京天根生化科技有限公司。引物應用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成。電子天平購自上海天平儀器廠；大鼠尾動脈血壓測定儀購自美國Kent Scientific 公司；多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 擴增儀購自美國Bio-Rad公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 動物分組及給藥 20只SHR 大鼠適應性喂養1周后測其尾動脈血壓，編號以后按照隨機數字表法分為模型組和依那普利組，每組10 只，另取10 只WKY 大鼠作為對照組。依那普利組的給藥劑量為1.05 mg/（kg·d），每日1次灌胃，持續10周，模型組和對照組灌胃等量生理鹽水。10周后處死動物并取材。

1.4 血壓及血、尿指標檢測 各組在給藥前（0周）及給藥后每2 周測定大鼠尾動脈血壓。10 周后處死大鼠前留取尿液離心取上清，處死后取腹主動脈血靜置30 min 離心取上清，采用脲酶法檢測各組血清中BUN水平，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組AngⅡ、CysC、mALB水平。

1.5 腎組織形態結構觀察 大鼠處死后切取腎組織，去包膜后多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片。按以下步驟進行Masson染色：將切片常規脫蠟及水化，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色5～10 min；用酸性乙醇分化后水洗；Masson藍化液返藍，水洗；蒸餾水洗1 min 后麗春紅品紅染色液染色5～10 min。在上述操作過程中按蒸餾水∶弱酸溶液=2∶1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min，直接入苯胺藍染色液中染色1～2 min；弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水3 次，每次5～10 s；二甲苯透明3次，每次1～2 min。最后中性樹膠封固，待切片干燥后，在光學顯微鏡下觀察典型病變部位并拍照。

1.6 腎組織AngⅡ、TGF-β1及下游纖維化標志物mRNA的表達 在無RNA酶條件下提取腎組織RNA，測定濃度后用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA，用SuperReal熒光定量預混試劑盒在PCR擴增儀上進行實時熒光定量PCR，擴增條件為：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達水平，引物序列見表1。

1.7 統計學方法 所有數據均通過SPSS 21.0 軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，組內多個時間點間比較采用重復測量資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequences involved in the gene of interest表1 內參和目的基因引物序列

2 結果

2.1 依那普利對SHR大鼠的降壓效果 組內比較：對照組收縮壓在干預4 周時開始升高，舒張壓則無明顯變化（P＞0.05）；模型組收縮壓在干預2 周時開始升高，舒張壓則無明顯變化（P＞0.05）；依那普利組收縮壓和舒張壓均在干預2周時開始下降。組間比較：給藥前（0 周），與對照組相比，模型組和依那普利組大鼠收縮壓與舒張壓均顯著升高（P＜0.05）；模型組與依那普利組收縮壓與舒張壓比較差異無統計學意義（P＞0.05）；藥物干預后，與模型組比較，依那普利組的收縮壓與舒張壓均顯著下降（P＜0.05）。見表2、3。

2.2 依那普利對SHR 大鼠血清AngⅡ及腎功能的影響 與對照組比較，模型組AngⅡ、BUN、CysC 和尿mALB 水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，依那普利組上述指標均顯著下降（P＜0.05），見表4。

2.3 依那普利對SHR 腎臟形態結構的影響 Masson 染色結果顯示，對照組大鼠腎組織中可見少量藍色的膠原纖維沉積，模型組大鼠腎組織出現大量藍色膠原纖維沉積，依那普利組的膠原纖維沉積程度較模型組明顯減輕，見圖1。

2.4 依那普利對SHR大鼠腎組織中AngⅡ、TGF-β1及下游纖維化標志物的mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組Ang Ⅱ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和Collagen Ⅳ的mRNA 相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，依那普利組的AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和Collagen Ⅳ的mRNA的相對表達量明顯降低（P＜0.05），見表5。

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表2 3組大鼠實驗期間收縮壓的變化（n=10，mmHg，±s）

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表2 3組大鼠實驗期間收縮壓的變化（n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；F組間=964.381＊＊，F時間=23.023＊＊，F交互=47.534＊＊；組間比較：a與對照組相比，b與模型組相比，P＜0.05；組內比較：A與0周相比，B與2周相比，C與4周相比P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

干預時間組別對照組模型組依那普利組F 0周132.10±5.72 177.50±6.98a 173.50±5.19a 174.813＊＊2周135.10±5.15 192.50±6.64aA 148.40±6.19abA 248.772＊＊4周138.40±5.72A 197.70±8.26aA 148.60±8.38abA 176.138＊＊6周139.70±8.92A 192.00±7.09aA 141.70±8.81bABC 127.05＊＊8周142.60±6.40A 195.20±5.16aA 144.60±6.31bA 248.243＊＊10周143.70±5.03A 195.10±6.81aA 144.20±5.53bA 255.795＊＊F 4.932＊＊11.074＊＊29.136＊＊

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表3 3組大鼠實驗期間舒張壓的變化（n=10，mmHg，±s）

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in three groups of rats表3 3組大鼠實驗期間舒張壓的變化（n=10，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；F組間=4.703＊＊，F時間=2.190，F交互=279.106＊＊；組間比較：a與對照組相比，b與模型組相比，P＜0.05；組內比較：A與0周相比，B與2周相比，P＜0.05

組別對照組模型組依那普利組F干預時間0周113.60±7.93 143.80±7.52a 139.00±4.22a 57.532＊＊2周112.20±6.09 148.10±8.09a 125.30±5.76abA 73.002＊＊4周116.70±6.34 146.10±9.89a 126.50±8.87abA 30.996＊＊6周118.50±5.78B 141.00±8.81a 121.20±7.80bA 25.053＊＊8周117.70±6.58 141.00±6.86a 121.90±5.63bA 37.889＊＊10周117.70±8.15 146.50±4.84a 120.90±7.78bA 49.714＊＊F 1.382 1.420 10.003＊＊

Fig.1 Effects of enalapril on renal fibrosis in SHR(Masson staining,×200)圖1 依那普利對SHR腎纖維化的影響（Masson染色，×200）

Tab.4 Comparison of serum AngⅡ,BUN,CysC and mALB levels between three groups表4 3組大鼠血清AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB水平的比較（n=10，±s）

Tab.4 Comparison of serum AngⅡ,BUN,CysC and mALB levels between three groups表4 3組大鼠血清AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB水平的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與模型組相比，P＜0.05

組別對照組模型組依那普利組F AngⅡ（ng/L）72.93±5.00 158.31±12.14a 83.19±12.35b 100.362＊＊BUN（mmol/L）4.60±0.56 7.92±2.09a 5.40±0.98b 9.564＊＊CysC（μg/L）128.37±6.31 156.45±13.50a 135.96±11.59b 10.178＊＊尿mALB（mg/L）4.69±1.31 8.08±1.56a 5.39±0.85b 7.980＊＊

Tab.5 Changes of AngⅡ,TGF-β1,Smad2,Collagen Ⅰand Collagen ⅣmRNA in three groups表5 3組大鼠腎組織AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA表達變化（n=10，±s）

Tab.5 Changes of AngⅡ,TGF-β1,Smad2,Collagen Ⅰand Collagen ⅣmRNA in three groups表5 3組大鼠腎組織AngⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA表達變化（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與模型組相比，P＜0.05

組別對照組模型組依那普利組F AngⅡ1.08±0.33 2.16±0.40a 1.24±0.31b 8.332＊＊TGF-β1 1.00±0.09 2.27±0.50a 1.39±0.50b 7.564＊＊Smad2 1.01±0.16 3.95±0.90a 1.39±0.86b 14.143＊＊組別對照組模型組依那普利組F Smad3 1.00±0.28 2.88±0.88a 1.37±0.41b 8.548＊＊collagenⅠ1.01±0.18 3.74±0.68a 1.26±0.37b 32.602＊＊collagenⅣ1.06±0.49 3.78±1.03a 1.28±0.32b 14.465＊＊

3 討論

腎臟既是血壓調控的重要器官，也是高血壓損傷的靶器官之一。血壓的升高會導致血管內皮功能損傷和腎臟缺血，使腎臟中RAAS 激活。AngⅡ是RAAS 中最重要的效應物，可通過作用于血管內皮細胞等細胞上的AT1R，激活一系列酶蛋白，直接或間接引起血管平滑肌細胞收縮、促進醛固酮的分泌、引起血管重塑、興奮交感神經，從而導致血壓升高，并發揮促炎癥反應、促纖維化效應。有研究認為RAAS激活是造成腎臟損害的初始因素［8］。

長期的高血壓使腎血管阻力增加，結構發生改變，腎小動脈管壁增厚，管腔狹窄，腎血流量逐漸減少，最終引起腎臟缺血性損害，尿微量白蛋白增加，出現蛋白尿。BUN 是臨床常用的腎功能檢測指標。CysC可自由通過腎小球濾過膜，并在腎近曲小管被重吸收和分解，當腎小球出現損傷時，CysC 水平會升高［9］。因此，CysC也是評價早期腎功能損傷和腎小球濾過功能下降的重要指標。本實驗中血壓監測及血、尿檢測結果顯示，模型組的血壓以及AngⅡ、BUN、CysC、尿mALB 較對照組均出現升高，提示隨著血壓的升高，RAAS激活，造成了SHR腎臟功能損傷和腎小球濾過功能下降。給予依那普利后，上述指標均明顯改善并恢復至接近正常水平，表明依那普利可能通過抑制RAAS 的激活，使SHR 的血壓下降，并對高血壓引起的腎小球損傷有保護作用。

腎臟的纖維化也被認為是反映腎功能損傷程度的主要指標，是各種進行性腎臟疾病的共同終點，主要表現為細胞外基質（ECM）的過度沉積［10］。研究指出，AngⅡ能夠導致腎纖維化［11］，其機制可能與其能誘導TGF-β1等促纖維化因子的表達有關［12］。有研究表明，TGF-β1是可促使膠原等ECM生成增加、降解減少，導致腎纖維化、腎功能受損最關鍵的細胞因子［13］。目前研究證實TGF-β1/Smads 信號通路是TGF-β1行使其功能的主要通路，也是腎纖維化的主要通路［14-15］。經典TGF-β/Smads信號通路的激活過程大致為：TGF-β1 首先與其Ⅱ型受體結合，后者出現二聚化并導致自身的磷酸化，磷酸化的Ⅱ型受體進一步磷酸化TGF-β1 的Ⅰ型受體，導致Ⅰ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶激活，從而特異性識別并激活Smad2和Smad3，激活后的Smad2/3與受體解離并與細胞質內Smad4結合，形成異源復合物，轉導進入細胞核，激活數種促纖維化因子，促進纖維化［15-16］。

本研究病理結果顯示，SHR 腎臟中大量膠原纖維沉積，發生明顯的纖維化，提示血壓的持續升高導致腎臟的纖維化，依那普利組的纖維化程度減輕。qRT-PCR 結果顯示模型組腎臟組織中AngⅡ的mRNA 相對表達量較對照組顯著升高，TGF-β1、Smad2、Smad3、CollagenⅠ和CollagenⅣ的mRNA 表達也有明顯增加，表明模型組腎臟在高AngⅡ水平的刺激下，TGF-β/Smads 通路被激活，ECM 生成增多，發生了纖維化。而依那普利組的上述指標均較模型組下降，提示依那普利可通過降低腎組織中AngⅡ的水平，抑制TGF-β/Smads 信號通路的激活與傳導，降低纖維化相關因子的表達，改善腎纖維化。

如今各國的指南中都將ACEI 作為臨床降壓的基礎藥物，且有研究證實高血壓在發病初始階段即會對靶器官造成損傷，建議在高血壓早期就關注并采取措施，防止高血壓介導的器官損害的發展［17］。本研究證實，在SHR 高血壓的早期即進行干預，ACEI 可以通過阻斷AngⅡ對腎臟的作用，在降壓的同時減輕高血壓引起的腎臟損傷，顯著改善腎纖維化，其作用機制可能與降低AngⅡ水平、抑制TGF-β/Smads 信號通路的表達有關。目前的研究發現除RAAS 外，高血壓引起的腎臟纖維化還可能與上皮間質轉化（EMT）［18］、炎癥反應和氧化應激［19］、MicroRNA 的調控［20］等有關。ACEI在上述的機制和通路中發揮何種作用還有待深入研究。