Salubrinal通過eIF2α信號通路治療非酒精性脂肪肝

張詩琪，劉大全，2，李心樂，2，張平，2，3△

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一種肝內脂質代謝異常綜合征，其誘因可能與肥胖、高脂飲食引起的過量脂質攝入有關［1］。肝細胞發生脂肪變性是NAFLD的早期病理改變之一；且肝細胞內脂質沉積的增加也是疾病進展的重要標志［2］。內質網（ER）是細胞內脂質合成的重要部位。研究表明，ER應激在脂質代謝調節中起到至關重要的作用，并可以影響肝細胞內脂質積累［3-4］。雖然證據表明ER應激參與調控脂肪肝的發生進展，但對于ER應激在肥胖引起的NAFLD 中的作用還需進一步探討。Salubrinal 是一種真核翻譯起始因子2α（eIF2α）去磷酸化的選擇性抑制劑，可以保護細胞免受ER應激誘導的凋亡損傷［5］。本課題組前期實驗證實，Salubrinal 可以通過維持eIF2α磷酸化促進骨創傷的愈合［6］，調節骨髓間充質干細胞成骨分化進而改善骨丟失［7］，并在改善骨質疏松和缺血性骨壞死方面也有顯著效果［8-9］。盡管研究證實Salubrinal通過調控eIF2α相關信號通路可以緩解許多疾病，但其在肥胖和脂質代謝中的作用尚不清楚。因此，本課題組提出ER應激在肥胖誘導的NAFLD 中發揮關鍵作用，而Salubrinal 可通過eIF2α 信號通路抑制ER 應激從而調控脂質代謝的假說。為驗證此假說，本研究通過建立NAFLD模型，評估Salubrinal 對肥胖和肝脂肪變性的影響，探討ER 應激調控脂質沉積的關鍵作用及潛在病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30 只SPF 級雌性C57BL/6 小鼠，14 周齡，體質量約為18 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號為SYXK（津）：2016-0012；動物飼料購于北京華阜康生物有限公司。實驗過程中動物自由攝水、食；保持室溫環境約25 ℃，12 h/12 h 明暗循環照明條件。實驗動物飼養和管理遵循天津醫科大學動物管理規定進行，本研究由天津醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑 Salubrinal 購于Tocris Bioscience 公司；血糖、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）比色試劑盒購于Cardio Chek 公司。主要抗體：熱休克蛋白70 蛋白5（Bip）兔源抗體購于美國Invitrogen公司（二抗為山羊抗兔，抗體批號為PA1-014A）；真核啟動因子2α（eIF2α）、真核啟動因子2α 磷酸化（p-eIF2α）、轉錄激活因子4（ATF4）、內參β-actin兔源抗體購于Cell Signaling 公司（二抗均為山羊抗兔，抗體批號分別為#9722、#9721、#11815和#8480）；CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）兔源抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司（二抗為山羊抗兔，抗體批號為15204-1-AP）；其他試劑購于Sigma公司。

1.1.3 實驗儀器 動物體成分分析儀購于Impedi Vet 公司；RM2255石蠟切片機及冰凍切片機購于Leica公司；CKX41SF倒置相差顯微鏡及BX41-12H02 普通正置顯微鏡購于Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將30只動物分為對照（SCD）組、高脂飲食（HF）組和高脂飲食+Salubrinal 治療（HF+S）組，每組10 只。除SCD 組給予標準食物喂養外，其余2組給予含脂量為60%的高脂飲食喂養。

1.2.2 給藥方法 將10 mg Salubrinal溶于50 mL丙二醇溶劑中，渦旋震蕩充分混勻溶解后完成治療藥物制備；對照試劑為丙二醇［9］。4周高脂肪喂養后，HF+S組接受Salubrinal皮下注射治療，Salubrinal 注射劑量1 mg/kg，每日固定時間注射1次，治療時間為4周；同時給予SCD組和HF組注射等量的對照試劑［7］。

1.2.3 體成分和生化分析 攝食量每3 d測定1次，動物體質量、體成分每周測定1 次，小鼠體質量指數（BMI）采取g/cm2計算，身體長度以小鼠鼻子到尾部的標準進行測量［10］。所有數據均由本實驗外專業人員測定并記錄。動物處死前禁食12 h，取眼眶血進行空腹血糖、TC、TG測定。

1.2.4 組織取材 治療4周后處死動物，分離并收集小鼠皮下、子宮周、腎周脂肪及肝臟樣本進行濕質量測定并記錄。留取部分小鼠肝臟組織固定于4%多聚甲醛中，用于下一步組織學分析。

1.2.5 組織學分析 小鼠肝臟組織樣本固定在4%多聚甲醛48 h 后進行下一步脫水處理。部分樣本組織經乙醇梯度脫水后包埋于石蠟中，切片厚度為5 μm，連續切片后通過HE染色觀察肝臟病理形態變化。另一部分樣本組織經蔗糖梯度脫水后用于冰凍切片，切片厚度為8 μm，連續切片后通過油紅O 染色觀察肝臟脂質沉積情況。每組樣本選取同一位置的石蠟或冰凍切片，并在光鏡下觀察、測量統計。

1.2.6 Western blot 分析 稱取肝組織樣本50 mg，使用高壓滅菌過的組織剪剪碎并置于研磨管中處理，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液500 μL，冰上裂解20 min 后，4 ℃下14 000 r/min 離心15 min，提取上清液并測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE，上樣細胞總蛋白濃度為30 μg，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃下過夜孵育一抗，TBST清洗3 次，室溫孵育二抗2 h，ECL 化學發光后曝光檢測。測量軟件采用Image J 分別測定目的蛋白和β-actin 灰度值，目的蛋白/β-actin代表蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，所有計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Salubrinal減輕高脂飲食引起的體質量增加 見表1。與SCD 組相比，HF 組與HF+S 組體質量明顯增加（均P＜0.05），第2 周、第4 周HF 組與HF+S 組間體質量差異無統計學意義。Salubrinal治療2周后（第6 周），HF+S 組小鼠體質量較HF 組減輕（P＜0.05），并在4周的治療時間內逐漸穩定。此外，3組間平均每日攝食量差異無統計學意義。

2.2 Salubrinal緩解高脂飲食誘導的肥胖 治療第4周體成分分析表明，與SCD 組相比，HF 組小鼠BMI升高，而HF+S 組較HF 組BMI 降低（均P＜0.05），并恢復到SCD組水平。同時，HF組較SCD組全身體脂率明顯增加，Salubrinal 降低HF+S 組小鼠全身體脂率，但體脂率水平仍高于SCD 組（均P＜0.05），見表2。此外，實驗結束前觀察動物體型可見，與SCD 組相比，HF組小鼠肥胖體型更明顯，治療后HF+S組與HF組相比體型較小，見圖1。

Tab.1 Changes of body mass and average daily food intake throughout the experiment between three groups of C57BL/6 mice表1 實驗過程中3組小鼠的體質量變化和每日平均攝食量比較（n=10，g，±s）

Tab.1 Changes of body mass and average daily food intake throughout the experiment between three groups of C57BL/6 mice表1 實驗過程中3組小鼠的體質量變化和每日平均攝食量比較（n=10，g，±s）

＊＊P＜0.01；a與SCD組比較，b與HF組比較，P＜0.05；表2～6同

組別SCD組HF組HF+S組F第2周體質量19.75±0.36 22.55±1.05a 22.62±0.95a 37.554＊＊第4周體質量21.44±1.47 25.43±1.11a 25.00±1.51a 25.310＊＊第6周體質量22.24±1.25 27.94±1.76a 26.05±2.17ab 27.093＊＊第8周體質量23.58±1.74 31.79±1.87a 27.22±1.99ab 48.414＊＊平均每日攝食量2.16±0.08 2.16±0.16 2.21±0.06 1.148

Tab.2 Comparison of body composition(BMI and body fat)between three groups of C57BL/6 mice表2 3組小鼠體成分（BMI和全身體脂率）比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of body composition(BMI and body fat)between three groups of C57BL/6 mice表2 3組小鼠體成分（BMI和全身體脂率）比較（n=10，±s）

組別SCD組HF組HF+S組F BMI（g/cm2，×10-2）33.91±2.14 45.21±2.45a 35.60±2.58b 64.477＊＊全身體脂率（%）35.82±2.71 48.26±3.56a 40.78±4.28ab 30.650＊＊

Fig.1 The body sizes of C57BL/6 mice at the end of experiment圖1 C57BL/6小鼠實驗結束前體型

2.3 Salubrinal 對肥胖小鼠的血脂、空腹血糖的影響 與SCD 組相比，HF 組TG、TC、空腹血糖明顯升高（均P＜0.05）。Salubrinal 治療后HF+S 組較HF 組TG、TC、空腹血糖水平降低（均P＜0.05），但TC、空腹血糖水平仍高于SCD組（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum TG,TC and fasting blood glucose between three groups of C57BL/6 mice表3 3組小鼠TG、TC和空腹血糖比較（n=10，mmol/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum TG,TC and fasting blood glucose between three groups of C57BL/6 mice表3 3組小鼠TG、TC和空腹血糖比較（n=10，mmol/L，±s）

組別SCD組HF組HF+S組F TG 0.62±0.03 0.97±0.17a 0.74±0.14b 19.502＊＊TC 2.57±0.21 4.49±0.54a 3.41±0.41ab 54.784＊＊空腹血糖4.44±0.425 8.68±2.44a 5.39±0.89ab 21.377＊＊

2.4 Salubrinal 減輕脂肪堆積 與SCD 組相比，HF組內臟及皮下脂肪堆積明顯，其中子宮周、腎周、皮下脂肪濕質量明顯增加（均P＜0.05）。Salubrinal 治療后，與HF組相比，HF+S組各部位脂肪濕質量明顯降低，脂肪堆積情況減輕，但仍高于SCD 組（均P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of mass of utenes,kidney and subcutaneals of fat between three groups of C57BL/6 mice表4 3組小鼠子宮周、腎周、皮下脂肪質量比較（n=10，g，±s）

Tab.4 Comparison of mass of utenes,kidney and subcutaneals of fat between three groups of C57BL/6 mice表4 3組小鼠子宮周、腎周、皮下脂肪質量比較（n=10，g，±s）

組別SCD組HF組HF+S組F子宮周脂肪0.19±0.06 0.72±0.24a 0.39±0.14ab 26.708＊＊腎周脂肪0.14±0.08 0.62±0.18a 0.30±0.15ab 29.825＊＊皮下脂肪0.17±0.09 0.98±0.46a 0.52±0.26ab 17.384＊＊

2.5 Salubrinal 對肥胖小鼠肝臟的保護作用 各組肝臟大體標本對比可見，與SCD 組相比，HF 組小鼠肝臟腫大，色澤為淡黃，切面結構模糊，有油膩感；而HF+S組小鼠肝臟較HF組形態較小，色澤紅潤光澤，見圖2、表5。HE 染色結果見圖3，與SCD 組肝組織切片鏡下視野相比，HF 組肝小葉形態欠規則，胞漿中出現大小不一融合性空泡（箭頭所示），形似脂肪細胞，肝細胞氣球樣變明顯，細胞核偏移，細胞排列紊亂；Salubrinal 治療后，HF+S 組肝小葉結構較HF組規則，胞漿內無明顯脂質小滴，細胞核圓排列整齊。油紅O染色結果見圖4，相比于SCD組，HF組鏡下視野中出現明顯脂滴著染顆粒，呈紅色（箭頭所示），而HF+S 組較HF 組脂滴數目明顯減少。此外，SCD組肝組織內無明顯脂滴形成，HF組脂滴數目與SCD組相比明顯增多（P＜0.05），而Salubrinal治療后HF+S 組較HF 組脂滴數目顯著減少（P＜0.05），見表5。

Fig.2 General observation of liver tissues in three groups of mice圖2 3組小鼠肝臟肉眼下觀察

Tab.5 Comparison of liver weight and the number of lipid droplets between three groups of C57BL/6 mice表5 3組小鼠肝臟質量和肝臟脂滴數目比較 （±s）

Tab.5 Comparison of liver weight and the number of lipid droplets between three groups of C57BL/6 mice表5 3組小鼠肝臟質量和肝臟脂滴數目比較 （±s）

組別SCD組HF組HF+S組F肝臟質量（n=10，g）1.78±0.14 2.44±0.41a 2.07±0.23ab 13.597＊＊肝臟脂滴數目（n=7，個/視野）0 110.29±31.68a 11.71±6.73b 73.448＊＊

Fig.3 Changes of pathology of liver under light microscope in three groups(HE staining,×200)圖3 3組小鼠肝臟病理改變光鏡下觀察（HE染色，×200）

Fig.4 Changes of liver lipid droplet deposition under light microscope in three groups(Oil red O staining,×200)圖4 3組小鼠肝臟脂質小滴光鏡下觀察（油紅O染色，×200）

2.6 Salubrinal 對肝組織中eIF2α 信號通路相關蛋白表達的影響 肝組織蛋白印跡檢測分析表明，與SCD 組相比，HF 組p-eIF2α/eIF2α 表達量無顯著變化，Bip、ATF4和CHOP的表達水平顯著升高（均P＜0.05）。與HF 組相比，Salubrinal 治療后增加了peIF2α/eIF2α 表達量，并進一步增強Bip、ATF4 的表達水平（均P＜0.05），但是顯著降低了CHOP表達量（P＜0.05）；與SCD 組比較，HF+S 組CHOP 表達水平差異無統計學意義，見圖5、表6。

Fig.5 The marker proteins of eIF2α signaling pathway detected by Western blot assay in three groups圖5 Western blot檢測3組eIF2α信號通路相關蛋白的表達

Tab.6 Effects of salubrinal on eIF2α signaling pathway related proteins that expressed in the liver tissues表6 Salubrinal對3組肝樣本eIF2α信號通路相關蛋白表達的影響（n=3，±s）

Tab.6 Effects of salubrinal on eIF2α signaling pathway related proteins that expressed in the liver tissues表6 Salubrinal對3組肝樣本eIF2α信號通路相關蛋白表達的影響（n=3，±s）

組別SCD組HF組HF+S組F Bip 0.42±0.03 0.68±0.08a 0.81±0.04ab 37.948＊＊p-eIF2α/eIF2α 0.74±0.10 0.61±0.15 1.26±0.18b 16.412＊＊ATF4 0.22±0.05 0.47±0.11a 0.89±0.14ab 30.186＊＊CHOP 0.20±0.11 0.93±0.15a 0.40±0.11b 27.002＊＊

3 討論

3.1 Salubrinal 可以有效緩解由高脂飲食誘導的肥胖 高熱量攝入導致的肥胖癥是目前世界范圍內主要公共衛生問題之一，是導致慢性疾病如心血管疾病、NAFLD、2 型糖尿病和某些癌癥的主要因素［11］。在人群大樣本隊列分析中，BMI 和機體總肥胖與相關代謝性疾病的風險呈正相關。本研究結果表明，通過高脂飲食誘導的動物肥胖模型與正常飲食組相比，高脂組的體質量明顯升高，且通過體脂率、BMI分析與動物體型觀察可見，高脂組小鼠的肥胖表型更為明顯。經過4 周Salubrinal 治療后，治療組小鼠肥胖體型較高脂組緩解，BMI 和體成分分析表明小鼠的平均體脂率更接近正常飲食小鼠。

與全身總脂肪量相比，體內脂肪分布和脂肪組織功能受損能更好地預測胰島素抵抗和相關并發癥。同時，據相關報道，脂肪組織功能障礙主要是由受損的脂肪組織擴張、脂肪細胞肥大以及脂質代謝改變共同導致［12］。在本研究中，與正常組相比，高脂組小鼠體內各部位脂肪堆積均有所增加；相關血脂檢測也顯示，高脂組的TG、TC和空腹血糖指標均高于正常組小鼠。Salubrinal 明顯降低了小鼠皮下和臟器脂肪含量，同時血脂、空腹血糖水平也明顯降低。結果表明，高脂飲食會引起肥胖的發生，導致全身各部位脂肪積累增加，并造成機體血脂異常和胰島素抵抗的發生。Salubrinal 可通過減少全身和各部位脂肪堆積、調控脂質代謝，從而延緩高脂飲食誘導的肥胖癥發展。

3.2 Salubrinal 可減輕肥胖誘導的肝脂肪變性 能量攝入和能量消耗之間發生不平衡時，或者當脂肪組織中的脂質蓄積過多時，則導致機體肥胖；而當脂質出現在非脂肪組織器官（例如肝臟或大網膜）時，則發生“異位脂肪蓄積”［13］。NAFLD 開始的標志即為肝臟內脂質沉積引起的肝脂肪變性，并且明顯的肝脂肪沉積是疾病進展的危險因素［2］。研究表明，ER 應激引起的高膽固醇血癥會引起肝臟脂質沉積和肝脂肪變性［14］。雖然肝脂肪變性通常被認為是良性病變，但隨著脂質代謝的進一步紊亂，肝炎、肝硬化和肝癌的罹患風險會增加［15］。在本研究中，與正常組相比，肉眼觀察下高脂飲食組小鼠的肝臟組織發生明顯的腫大和脂肪變，且在光鏡下也發現肝組織中脂質沉積明顯，進一步證實了脂質代謝紊亂對肝臟的影響。Salubrinal 緩解了肝脂肪變性，通過降低肝臟內脂質沉積，抑制了NAFLD發展的進程。

3.3 Salubrinal 可 通 過eIF2α信號通路緩解NAFLD 目前，對于NAFLD的致病機制存在多種觀點，潛在致病機制可能與ER應激、氧化應激、胰島素抵抗有關［1］。多項研究表明，ER應激參與NAFLD中脂質沉積過程，近期有報道證實eIF2α 信號通路參與調控脂肪生成［16-17］。ER 應激不僅是肥胖及其相關代謝性疾病的致病因素，同時肥胖和肝脂肪變性的發展也會導致內質網穩態的進一步失衡，從而形成惡性循環，加劇疾病的進展。ER是真核生物細胞內蛋白質和脂質合成的主要場所，肝臟作為脂質代謝的重要器官，在“異位脂肪蓄積”發生時，ER 應激會通過介導非折疊蛋白反應調控脂質代謝［18］。在本研究中，高脂飲食組小鼠肝組織中Bip、ATF4表達水平的升高以及肝脂肪變性表明ER 應激的發生；Salubrinal 治療后肝組織內脂質沉積減少且伴隨著p-eIF2α/eIF2α 表達量的增加，表明Salubrinal 可通過調控ER應激降低脂質沉積和肝脂肪變性。同時，CHOP 作為eIF2α 信號通路與凋亡的連接體也參與調控脂質代謝［17］。據報道，抑制eIF2α/CHOP信號通路中CHOP 的表達量可以緩解胰島素抵抗的發生［19］。與此結論相一致，本研究表明，肥胖誘導的肝脂肪變性發生時，CHOP 表達量顯著上升，而Salubrinal 治療后，通過eIF2α 信號通路抑制CHOP的表達從而減少脂質沉積，調控脂質代謝。

綜上所述，本研究證明了eIF2α 在肥胖誘導的NAFLD中的關鍵作用，Salubrinal可緩解肥胖造成的脂肪蓄積和血脂、血糖紊亂，并通過減少肝組織中脂肪沉積抑制肝脂肪變性的進一步發展。此外，本研究證實了Salubrinal 治療NAFLD 的相關機制，即Salubrinal 可通過eIF2α 信號通路調控ER 應激從而緩解肝脂肪變性，并抑制脂質沉積。