葉酸代謝相關基因多態性與男性精子異常的相關性研究

王志強，陜文生△，田昕，劉春輝，孫慶梅，俞國強，劉霄雯

據世界衛生組織（WHO）統計，全世界約有15%的育齡夫婦遭受不育的困擾，其中男方因素約占50%［1］。男性不育中高達60%～75%為特發性男性不育，表現為原因不明的少精、弱精和（或）畸形精子癥等精子質量異常［2］。隨著基因檢測技術的發展，從遺傳角度探索特發性男性不育的原因成為目前的研究熱點，其中葉酸代謝相關基因多態性與男性不育的關聯性越來越受到關注。葉酸代謝關鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因多態性可改變酶活性，一方面影響DNA 甲基化過程［3］，另一方面可導致高同型半胱氨酸（HCY）血癥［4］，兩者均可影響正常精子發生的過程以及精子活力，最終降低男性生育能力。但目前研究對葉酸代謝基因多態性與男性不育的相關性尚存爭議。研究多針對MTHFR C677T位點，而有關MTHFR A1298C和MTRR A66G位點的研究尚少見，而后兩個位點多態性也是影響葉酸代謝及高HCY血癥的重要因素。本研究針對有精子質量異常的特發性男性不育患者及有不良孕產史的男性患者進行MTHFR 和MTRR 基因多態性的檢測，探討MTHFR C677T、MTHFR A1298C 和MTRR A66G 位點基因多態性與男性不育的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月—12月在甘肅省婦幼保健院男科就診的漢族男性929 例，年齡19～45 歲，平均（30.56±4.98）歲。其中患有精子異常癥者（精子異常組）290例，平均年齡（29.85±4.85）歲；妻子有不明原因不良生育史者（不良孕產組）198例，平均年齡（31.41±5.60）歲；妻子有自然生育史的健康者（對照組）441 例，平均年齡（30.64±4.70）歲，3 組間年齡差異無統計學意義（F=0.423，P＞0.05）。納入及排除標準：（1）在男科就診并進行葉酸代謝能力遺傳檢測的患者。（2）精子異常組接受精液常規分析被確定為弱精/少精/精子畸形癥（《WHO 人類精液處理檢查與實驗室手冊》第5 版）。（3）排除患有泌尿系統疾病、性傳播疾病、染色體異常、免疫異常等疾病患者以及患精神疾病、惡性腫瘤等不能配合研究者。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器及試劑 Buffer A、Buffer B、飽和酚、氯化鈉及異丙醇等試劑以及低溫離心機（Beckman J-6BABI）、7900 型熒光定量PCR 儀等儀器均購自美國Applied Biosystems（ABI）公司。

1.3 基因多態性分析方法 采集口腔黏膜上皮細胞，采用硅膠吸附法提取基因組DNA。采用熒光定量PCR 技術檢測MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位點單核苷酸多態性（SNP）。PCR 反應體系為10 μL，包含1 μL 基因組DNA（20 mg/L），5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB 探針（序列見表1），3.5 μL 去離子水。反應條件：95 ℃預變性10 min；92 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，20個循環；89 ℃變性15 s，60 ℃延伸90 s，30 個循環。反應完成后，在ABI 7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結果。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，多重比較行LSD-t檢驗；各基因型分布、等位基因頻率比較采用χ2檢驗。采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗各組樣本代表性。采用Logistic 回歸分析不良妊娠的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Location of Taqman-MGB probe表1 Taqman-MGB探針所在位置

2 結果

2.1 各基因位點基因型的Hardy-Weinberg 平衡分析 精子異常組、不良孕產組和對照組男性MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 位點基因型符合Hardy-Weinberg 平衡定律（精子異常組χ2分別為0.409、0.010、3.464，不良孕產組χ2分別為0.909、2.514、0.040，對照組χ2分別為3.588、0.851、0.873，均P＞0.05），3組樣本均具有群體代表性。

2.2 MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 基因型及等位基因分析 精子異常組和不良孕產組的MTHFR C677T 位點TT 基因型頻率均高于對照組（P＜0.05），等位基因分布與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。精子異常組的MTHFR A1298C位點基因型和等位基因分布與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。不良孕產組的MTHFR A1298C位點CC 基因型頻率高于對照組（P＜0.05），等位基因分布與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。精子異常組和不良孕產組的MTRR A66G 位點AG、GG 基因型頻率高于對照組（P＜0.05），等位基因分布與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、3。

2.3 精子異常及不良孕產發生的多因素Logistic 回歸分析 分別以精子異常（對照組=0，精子異常=1）、不良孕產（對照組=0，不良孕產=1）為因變量，以MTHFR C677T（CC=0，CT=1，TT=2）、MTHFR A1298C（AA=0，AC=1，CC=2）和MTRR A66G（AA=0，AG=1，GG=2）為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析。結果顯示，MTHFR C677T 位點的TT 基因型和MTRR A66G的AG、GG基因型是精子異常發生的獨立危險因素（P＜0.05）；MTHFR C677T 位點的TT 基因型、MTHFR A1298C 位點的CC 基因型和MTRR A66G的AG、GG基因型是不良孕產發生的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of genotype frequency distribution between MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G groups表2 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 3組基因型頻率分布比較［例（%）］

Tab.3 Comparison of allele frequency distribution between MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G groups表3 3組MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G等位基因頻率分布比較［例（%）］

Tab.4 Multi-Logistic regression results of risk factors for sperm abnormality and adverse pregnancy表4 精子異常、不良孕產的多因素分析

3 討論

MTHFR 是葉酸代謝的關鍵酶，其將5，10-亞甲基四氫葉酸（5，10-methylenetetrahydrofolate，5，10-MTHF）轉化為5- 甲基四氫葉酸（5-methyl tetrahydrofolate，5-MTHF），5-MTHF 為體內DNA、RNA 及蛋白質等物質的合成提供甲基，保證精子的順利生成［5］。同時，5-MTHF 為高HCY 向甲硫氨酸（Methionine，Met）轉化提供甲基，維持機體HCY 正常水平。MTHFR基因突變可引起酶活性降低，影響DNA 甲基化，導致染色體分離異常，影響精子的產生及功能［6］?；A研究方面，有研究表明敲除雄性小鼠的MTHFR 基因后，小鼠精子發育異常，最終導致不育［7］。Oakes 等［8］研究顯示，給予小鼠甲基轉移酶抑制劑可抑制其DNA甲基化反應，小鼠的精子活力低下。另一方面MTHFR 基因多態性可使體內HCY 水平升高，造成高HCY 血癥，從而產生過量氧化應激反應，損傷精子DNA，引起精子功能異常［9］。而臨床研究的結果卻不一致，鄒宇潔等［10］研究結果表明，MTHFR C677T基因多態性與男性不育人群的精子質量相關，其機制可能與精液活性氧水平有關；而胡麗麗等［11］對濟寧地區的漢族男性進行研究，結果未發現MTHFR C677T 基因多態性與特發性男性不育癥存在相關性。Gava 等［12］研究發現MTHFR C677T 多態性與巴西男性不育有密切關聯；針對約旦人群的研究結果顯示，MTHFR C677T多態性與男性不育有關，但與不育組的精液參數無相關性［6］；另有研究顯示，西班牙人群中MTHFR C677T多態性在不育組與對照組的分布差異無統計學意義［13］。這些差異可能與不同種族或不同地區的人群差異有關，也可能與樣本量差異有關。本研究結果顯示，精子異常組與對照組在MTHFR C677T 位點基因型分布上有顯著差異，TT 基因型頻率顯著高于對照組，而CT基因型頻率卻低于對照組，該位點等位基因頻率分布上無顯著差異。提示該位點TT 基因型可能是導致精子異常的因素，而CT基因型與精子異常的發生無關聯性。Logistic 回歸分析結果顯示，MTHFR C677T 位點的TT 基因型是精子異常發生的獨立危險因素，此純合突變基因型發生精子異常的風險是CC野生型的1.65倍，與基因型分布規律一致。

MTRR 在HCY 的復甲基代謝途徑中起重要作用，其協同輔酶維生素B12維持甲硫氨酸合成酶（Methionine synthase，MTR）的活性，使MTR 以5-MTHF為底物，催化HCY合成Met。MTRR基因突變會降低MTRR 活性，從而無法維持MTR 活性，阻礙HCY向Met轉化，可能造成高HCY血癥［14］。高HCY血癥能使大量氧自由基在細胞內聚集，可能導致精子線粒體和核DNA 損傷，影響精子正常功能，降低生育能力［9］。本課題組前期研究結果表明，隨著HCY 水平的增高，精子DNA 碎片指數（DNA fragmentation index，DFI）水平也呈增高趨勢。高HCY 血癥還會損傷血管內皮，可能引起睪丸中血管發生動脈硬化，影響睪丸血流，導致生精功能障礙［15-16］。MTRR A66G 位點與男性不育的關聯性在國內的研究相對較少，國內外的臨床研究成果爭議也較大。Lee 等［17］研究表明，MTRR A66G 多態性是男性不育的獨立影響因素。而對巴西、約旦人群的研究結果顯示，MTRR A66G多態性與男性不育無相關性［6，12］。但因目前發表的研究成果均為小樣本研究，其結果說服力不足，還需擴大樣本量進一步研究驗證。本研究結果顯示，精子異常組與對照組在MTRR A66G 位點基因型和等位基因分布上均有顯著差異，精子異常組AG、GG基因型頻率均高于對照組，提示該位點基因多態性分布與精子異常的發生有相關性。Logistic回歸分析結果顯示，MTRR A66G的AG、GG基因型是精子異常發生的獨立危險因素，發病風險分別是野生型AA的4.199和5.849倍。

本研究還對妻子發生過不良孕產的男性葉酸代謝基因多態性進行了分析，其MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點的基因型分布與對照組存在顯著差異。Logistic 回歸分析結果顯示，MTHFR C677T 位點TT 基因型、MTHFR A1298C 位點CC 基因型和MTRR A66G 的AG、GG 基因型是不良孕產發生的獨立危險因素，不良孕產組以上4 個基因型頻率顯著高于對照組，這4 個基因型發生不良孕產的風險分別是各自的野生型MTHFR 677 CC、1298 AA 和MTRR 66 AA 的2.037、4.630、1.849、2.785倍。推測原因可能是MTHFR和MTRR基因突變影響機體DNA、RNA 及蛋白質等物質的甲基化，并引發高HCY血癥，導致精子發生結構或功能上的改變，造成不良孕產的發生。但因本研究樣本數量有限，仍需進一步研究驗證。

綜上所述，葉酸代謝相關基因MTHFR和MTRR的多態性與男性精子異常的發生具有相關性，且可能是不良孕產發生的危險因素。在不孕不育及孕前檢查中，女性的葉酸代謝遺傳基因現已受到臨床的重視，而男性的葉酸代謝相關基因多態性也應同樣得到關注。