低溫交聯時間對酸誘導羅非魚碎肉魚糜凝膠特性的影響

高 宇,畢保良,孔令富,李紅金,王曉雯,賈 丹

(云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201)

2018年云南省羅非魚(Oreochromisniloticus)的養殖總產量達到15.48萬噸,超過四大家魚,位居云南省第一,占云南省淡水魚養殖總量的26%[1]。云南省羅非魚主要以初級加工產品羅非魚片和冷凍羅非魚出口為主,深加工產品很少[2]。在魚片生產過程中會產生約占魚重10%的碎肉,目前大部分碎肉被制備成魚粉飼料,經濟附加值較低。張萍[3]利用碎肉來制備生化試劑蛋白胨,也有學者采用酶水解法來制備蛋白質水解液[4]或者活性肽[5]。因此如何合理高效地利用羅非魚碎肉,是目前羅非魚加工副產物利用亟待解決的主要問題之一。

魚糜制品是近幾年我國發展最為迅速的水產深加工產品之一,已有研究將羅非魚碎肉加工成熱誘導或酸誘導魚糜凝膠制品。目前熱誘導凝膠制品技術已經相當成熟且關于熱誘導凝膠及其凝膠形成機制的報道較多[6-7]。關于酸誘導凝膠的研究主要集中在葡萄糖酸內酯(glucono-δ-lactone,GDL)在低溫條件下誘導魚糜凝膠網絡結構的形成上。GDL在高水分體系中分解為葡萄糖酸和內酯,葡萄糖酸能使體系pH降至蛋白質等電點,使顆粒間的排斥力轉變為吸引力,在低溫條件下長時間交聯導致蛋白質聚集形成凝膠[8-9]。Riebroy等[10]研究發現大西洋鱈魚(Gardusmorhua)的肌動球蛋白添加GDL后,室溫放置48 h可以形成蛋白凝膠。鄭嚴等[11]研究發現當GDL添加量為2.1%、酸化溫度為35 ℃、酸化時間2.0 h可以制備高凝膠強度、冷藏即食的真鯛(Pagrusmajor)魚糜凝膠制品。鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)肌動球蛋白在4 ℃長時間的酸誘導條件下可以形成凝膠網絡結構,且其凝膠強度隨GDL含量的增加而提高[12]。但目前鮮有關于GDL對羅非魚碎肉凝膠特性影響方面的研究報道。實驗前期研究發現,獲得品質較高的低溫羅非魚碎肉蛋白凝膠,最適GDL添加量為2.4%,但交聯時間對酸誘導羅非魚碎肉凝膠特性的影響還有待研究。

因此,本研究以羅非魚碎肉為原料,研究酸誘導蛋白在低溫交聯過程中的化學作用力及凝膠特性的內在聯系,旨在揭示酸誘導羅非魚碎肉在低溫交聯過程中的凝膠形成機制,以期為高品質的低溫凝膠化產品在生產工業中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(Oreochromisniloticus)碎肉 云南新海豐水產科技集團有限公司;葡萄糖酸內酯(GDL) 北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸、二硫代硝基苯甲酸 Sigma公司。

TA-XTPlus物性分析儀 英國Stable Micro System公司;TU-1800紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器公司;高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍的羅非魚碎肉在4 ℃冰箱解凍12 h,去掉雜質、黑膜、結締組織,用5倍質量的自來水漂洗2次,再用5倍0.5% NaCl溶液漂洗1次,每次漂洗10 min,添加魚糜質量2.5%的NaCl斬拌,再添加魚糜質量2.4%的GDL和去離子水使魚糜水分含量達到80%,混合均勻后擠入直徑3.5 cm的聚偏二氯乙烯腸衣中,放置于4 ℃條件下,交聯時間分別為0、5、10、15、20和24 h,到達交聯時間后,去掉腸衣立即取樣。

1.2.2 魚糜凝膠自由氨基含量的測定 參考文獻[13],并修改如下:2 g魚糜凝膠溶解于18 mL硼酸緩沖液,均質,于75 ℃水浴15 min,60 ℃水浴2 h,4000×g離心5 min后取0.25 mL上清液,加2 mL磷酸緩沖液和2 mL 0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS),混勻,于50 ℃水浴60 min(錫箔避光),后用4 mL 0.1 mol/L HCl終止反應,室溫冷卻30 min 后,于340 nm測定其吸光值。標準曲線采用L-亮氨酸制作,標曲為y=0.1089x+0.0412,R2=0.9921。

1.2.3 魚糜凝膠二硫鍵含量的測定 參考Dan等[14]的方法。取2 g魚糜凝膠分散在20 mL的Tris-甘氨酸緩沖液中(pH8.0,含0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和8 mol/L尿素),12250×g下離心10 min,取上清液待用,并同時用Lowry法測定蛋白濃度。

測定游離巰基SHF含量時,移取200 μL二硫代硝基苯甲酸[(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]Ellman’s添加到4 mL的蛋白上清液中,室溫下反應1 h,于412 nm測定其吸光值。

測定總巰基SHT含量時,1 mL蛋白上清液中加入4 mL 20 mmol/L Tris-Gly緩沖液于40 ℃水浴1 h,然后用20%的三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白1 h,4000×g離心10 min,收集沉淀用20%的TCA漂洗3次,沉淀用l0 mL的Tris-甘氨酸緩沖液溶解。取200 μL的Ellman’s試劑添加到4 mL的蛋白溶液中,于412 nm測定其吸光值。

SHT、SHF含量根據公式(1)計算分別得到,S-S含量根據公式(2)表示:

SH(μmol/g protein)=73.53A412/c

式(1)

S-S(μmol/g protein)=(SHT-SHF)/2

式(2)

式中:c:蛋白濃度,mg/mL;A412:412 nm處的吸光值;73.53:106/13600,13600 mol·cm/L為摩爾消光系數。

1.2.4 魚糜凝膠化學作用力的測定 參考Ni等[15]的方法。取2 g魚糜凝膠分別與10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)混合并均質。于4 ℃靜置1 h,然后于12096×g離心15 min。用Lowry法測上清液中蛋白質的含量。離子鍵的貢獻以溶解于SB溶液中的蛋白質與溶解于SA溶液中的蛋白質的含量之差表示,氫鍵的貢獻以溶解于SC溶液中的蛋白質與溶解于SB溶液中的蛋白質的含量之差表示,疏水相互作用力的貢獻以溶解于SD溶液中的蛋白質與溶解于SC溶液中的蛋白質的含量之差表示。

1.2.5 魚糜凝膠強度的測定 除去腸衣,將魚糜凝膠切成直徑為20 mm的圓柱體,平衡至室溫,用質構儀進行穿刺實驗。采用P/0.25S型號的探頭對樣品進行一次壓縮,壓縮距離為15 mm,測前速度為1 mm/s,測試速度為1 mm/s,測后速度為1 mm/s,測試過程中出現的第一個峰值為破斷強度,峰值所對應的壓縮距離為凹陷深度,破斷強度與凹陷深度的乘積即表示凝膠強度[16]。

1.2.6 魚糜凝膠Texture Profile Analysis(TPA)參數的測定 參考殷俊等[17]的方法并略作修改。除去腸衣,將魚糜凝膠切成直徑為10 mm的圓柱體,并置于質構儀探頭正下方的樣品臺上,采用P/36R型號的探頭,測前速度為1 mm/s;測中速度為1 mm/s;測后速度為1 mm/s;采用70%的壓縮比例進行測試。選取彈性、硬度(kg)、粘聚性、咀嚼度(kg)和回彈性作為TPA參數,參數定義和計算方法參照Cardoso等[18]的報道。硬度表征魚糜凝膠能承受的最大力;彈性和回彈性則表征魚糜凝膠的彈性及形變后的恢復能力;粘聚性表征魚糜凝膠的粘性;咀嚼度則表征魚糜凝膠的咀嚼的難易程度,值小則咀嚼性差,值過大則難咀嚼,其值適中則適口性較好。

失水率(%)=(m1-m2)×100/m1

式(3)

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示,均采用GraphPad Prism.V5.0軟件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,USA)作圖,采用SAS 8.0 軟件(SAS Institute,Cary,North Carolina,USA)進行統計與分析。檢測實驗數據正態分布和方差齊性后,進行單因素方差分析(One-way ANOVA),然后用Duncan檢驗比較各樣本數據之間的差異顯著性,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 低溫交聯時間的酸誘導魚糜凝膠自由氨基的影響

低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠自由氨基含量的影響如圖1,在低溫條件下,隨著交聯時間的延長,自由氨基含量顯著降低(P<0.05),而交聯時間在5～10 h時魚糜凝膠的自由氨基含量之間沒有顯著性差異,當交聯時間為15～24 h自由氨基含量顯著下降(P<0.05)。說明在低溫條件下的酸誘導凝膠形成過程中,5～10 h交聯時間內生成的γ-羧酰胺基和伯胺發生交聯鍵的數量顯著高于0 h(P<0.05),而15～24 h交聯時間內生成的γ-羧酰胺基和伯胺發生交聯鍵的數量顯著高于0～10 h(P<0.05)。這是因為賴氨酸是谷氨酰胺轉胺酶(TGase)交聯反應的底物之一,TGase可以催化γ-羧酰胺基和伯胺發生交聯反應,導致自由氨基含量降低。因此賴氨酸含量(通過測定自由氨基而得)的變化通常用來表示TGase催化交聯反應的程度,自由氨基含量越低,說明γ-羧酰胺基和伯胺發生交聯鍵的數量越多[20]。

圖1 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠自由氨基的影響Fig.1 Effect of low temperature crosslinking timeon free amino group of tilapia surimi gel induced by acid注:不同大寫字母標注表示不同時間處理存在顯著差異(P<0.05);圖2～圖6同。

2.2 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠游離巰基(SHF)、總巰基(SHT)、二硫鍵(S-S)含量的影響

低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠SHF、SHT和S-S的影響如圖2。低溫酸誘導過程中,隨著交聯時間的延長,SHF含量隨著交聯時間的延長而下降,20～24 h交聯時間內的SHF含量顯著低于0～15 h(P<0.05),而SHT在5～24 h交聯過程中含量沒有顯著的變化(P>0.05),S-S含量隨著交聯時間的延長而增加,在20 h達到最高。前期研究發現,2.4% GDL作用魚糜24 h后,因GDL水解成葡萄糖酸使得魚糜pH下降到4.37(數據未呈現)。故在低溫條件下,蛋白質酸變性導致更多的SHF被氧化成S-S。S-S是半胱氨酸和胱氨酸的巰基被氧化生成的分子內和分子間的化學鍵。在蛋白質分子中巰基是最具活性的功能基團,巰基存在于肌球蛋白分子內部,當肌球蛋白結構發生變化,暴露出SHF,這些SHF就會發生氧化反應形成S-S[21]。

圖2 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠游離巰基(SHF)、總巰基(SHT)、二硫鍵(S-S)的影響Fig.2 Effects of low temperature crosslinking timeon free sulfhydryl,total sulfhydryl,disulfide bond oftilapia surimi gel induced by acid

2.3 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠化學作用力的影響

低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠化學作用力的影響如圖3。由圖3可知,隨著交聯時間的延長,羅非魚碎肉凝膠的氫鍵含量顯著降低。離子鍵含量呈先下降后上升趨勢,但整體來看,在低溫交聯過程中,酸誘導凝膠體系中離子鍵所占比例最小,疏水相互作用所占的比例最大,且隨著低溫交聯時間的延長,呈現先增后減的趨勢,且疏水相互作用促進了酸誘導凝膠網絡結構的形成。蛋白凝膠中,溶解于SA和SB溶液中的主要是肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白及一些低分子量的蛋白質[22],由此可知,在低溫酸誘導凝膠形成過程中,這些蛋白通過比非特異性結合、離子鍵更強的化學作用力存在于蛋白凝膠中,故在低溫交聯過程中,非特異性結合和離子鍵含量隨著交聯時間的延長而降低(24 h對應的離子鍵含量除外),且氫鍵含量也隨著交聯時間的延長而顯著下降(P<0.05)。這說明非特異性結合、離子鍵和氫鍵不是維持低溫酸誘導凝膠體系的主要化學作用力。這可能是在凝膠形成過程中,離子鍵和氫鍵參與肌球蛋白分子尾部的纏繞,而不參與頭部的聚集[23]。在酸處理過程中,離子鍵和氫鍵開始斷裂,蛋白變性,疏水基團開始暴露,體系產生疏水相互作用,造成肌球蛋白分子聚集。同時二硫鍵和γ-羧酰胺基和伯胺發生交聯鍵也開始形成,最終形成致密性較強的凝膠網絡結構。

圖3 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠非化學作用力的影響Fig.3 Effect of low temperature crosslinking time on the non-covalent bonds of tilapia surimi gel induced by acid注:a:非特異性結合;b:離子鍵;c:氫鍵;d:疏水相互作用。

2.4 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠特性的影響

2.4.1 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠強度的影響 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠強度的影響如圖4。隨著交聯時間的延長,碎肉魚糜凝膠的破斷強度在24 h顯著高于5～15 h(P<0.05),但15和20 h的凝膠的破斷強度無顯著性差異(P>0.05),這說明24 h魚糜凝膠中蛋白質分子間的緊實程度顯著高于5～15 h,而15和20 h凝膠的緊實程度無差異。凹陷深度在交聯5～20 h無顯著性差異,但24 h時凝膠的凹陷深度顯著低于15～20 h(P<0.05),這表明交聯24 h后魚糜凝膠的彈性較15～20 h相比反而有所下降。魚糜凝膠的凝膠強度在20 h顯著高于交聯5～15 h(P<0.05)。這是因為GDL水解形成葡萄糖酸,促進蛋白酸變性,且隨著交聯時間的延長,低溫條件下酸誘導過程中γ羧酰胺基和伯胺發生交聯鍵、二硫鍵和疏水相互作用使得蛋白之間聚集從而形成了高強度的凝膠。魚糜凝膠的破斷強度和凝膠強度均在20～24 h達到最高,但長時間的交聯(24 h)會使得蛋白凝膠的凹陷深度下降。

圖4 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠強度的影響Fig.4 Effects of low temperature crosslinking timeon gel strength of tilapia surimi gel induced by acid

2.4.2 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠TPA性能的影響 由圖5可以看出,在低溫過程中,隨著交聯時間延長,硬度、咀嚼度和回彈性都呈現先增后減的趨勢,當交聯時間為20 h時,魚糜凝膠的硬度達到最高,說明20 h時魚糜凝膠能承受的外力最強。而咀嚼度在15～20 h時達到最高?；貜椥栽?0 h達到最高,說明10h時魚糜凝膠形變后的恢復能力最強。隨著交聯時間的延長,回彈性呈下降趨勢,但整體來看,10～20 h時魚糜凝膠恢復形變的能力顯著(P<0.05)高于5和24 h的。而彈性隨著交聯時間的延長呈現上升的趨勢,但在10～24 h無顯著性差異(P>0.05)。粘聚性隨著交聯時間的延長無顯著性差異,而長時間的交聯(24 h)反而使得粘聚性有所下降。綜合魚糜凝膠的破斷強度、凹陷深度和凝膠強度指標,為了獲得較好的魚糜凝膠特性,最佳的低溫交聯時間為20 h。

圖5 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠質構的影響Fig.5 Effect of low temperature crosslinking time on gel texture of tilapia surimi gel induced by acid

2.5 低溫交聯時間對酸誘導魚糜凝膠失水率的影響

魚糜凝膠失水率與持水性成負相關,失水率越小,凝膠持水性能越好。蛋白凝膠的持水性與極性氨基酸結合水的能力、水分子分布、凝膠網絡結構等因素有關[24-25]。由圖6可知,當交聯時間在0～10 h之間,魚糜凝膠的失水率無顯著性差異(P>0.05),隨著交聯時間的增加,失水率呈現顯著上升趨勢(P<0.05)。說明隨著交聯時間的延長,凝膠的持水性下降。整體來說,酸誘導凝膠持水性都低于熱誘導魚糜凝膠,通常加熱魚糜凝膠的持水性與凝膠強度存在正相關關系[26],但本研究發現酸誘導魚糜凝膠的持水性和凝膠強度的變化并沒有呈現正相關。在低溫過程中,酸誘導凝膠形成過程中持水性的下降,可能是因為蛋白內部的疏水基團會逐漸暴露出來,疏水相互作用在酸凝膠中起主導作用,結果導致凝膠中的蛋白分子結合水分子的能力下降,從而降低了凝膠的持水性[27]。

圖6 低溫交聯時間對酸誘導羅非魚魚糜凝膠失水率的影響Fig.6 Effect of low temperature crosslinking timeon the expressible moisture of tilapia surimi gel induced by acid

3 結論

本研究表明,羅非魚碎肉在2.4% GDL誘導蛋白凝膠形成過程中,最佳的低溫交聯時間為20 h。在低溫酸誘導過程中,γ-羧酰胺基和伯胺產生的交聯鍵、二硫鍵和疏水相互作用使得碎肉蛋白之間發生交聯從而形成了高強度的凝膠。蛋白凝膠的質構特性隨著交聯時間的延長而增加,但持水性隨著交聯時間的延長而下降。這一結果為后續開發高品質的低溫凝膠化產品提供了重要依據。