菌種接種方式對黃豆醬品質的影響

古小露,謝躍杰,熊政委,王仲明,陳海楊,阮梅蘭,姜美娜,王 強,*

(1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶 400067; 2.重慶第二師范學院脂質資源與兒童日化協同創新中心,重慶 400067; 3.又石大學食品生命工程系,全羅北道全州 55338)

黃豆醬是我國傳統發酵豆制品,制曲和發酵是其制作工藝中的關鍵環節。黃豆醬原料由大豆和面粉組成,在制曲發酵階段,原料在以霉菌為主的微生物作用下,分解產生多肽、氨基酸、小分子糖類等,為后續發酵提供微生物生長活動所需的基礎物質[1],微生物產蛋白酶、淀粉酶和糖化酶的能力尤其重要,制曲發酵過程中醬醪的酶活直接影響原料利用率、發酵周期[2-3],決定了黃豆醬的品質。

研究發現,在傳統黃豆醬制作過程中微生物種類豐富,其中米曲霉、黑曲霉為主要作用霉菌[4-6]。在現代人工接種發酵中,采用單菌種制曲發酵、曲料混合發酵、多菌種混合制曲發酵、新型菌種制曲發酵等多種制曲發酵方法[7-13],黃豆醬呈現品質不均衡。曲料混合發酵是將單菌種成曲混合后發酵,多菌種混合制曲發酵則是多菌種混合后接種制曲直接進行發酵。枯草芽孢桿菌屬于益生菌,對人體動植物有益無害,由于其高蛋白酶活性被廣泛制作于酶制劑[14-15],在日本、韓國還用于制作納豆和韓國豆醬,但在中國傳統發酵豆制食品制作中應用較少[16-19]。

本實驗選取人工接種常用霉菌米曲霉、黑曲霉、甘薯曲霉、毛霉、紅曲霉、米根霉和工業常用微生物枯草芽孢桿菌為主要接種微生物,通過單菌種、2菌種、3菌種、4菌種、5菌種、6菌種和7菌種混合,研究單菌種制曲發酵、曲料混合發酵和多菌種混合制曲發酵三種發酵方式對醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量的影響,得到菌種最佳組合和最佳接種方式,進一步優化黃豆醬生產工藝和提高黃豆醬品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑龍江黃豆 市售;酪氨酸、福林酚試劑(Folin試劑)、三氯乙酸、可溶性淀粉、DNS試劑、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為分析純、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、麥芽汁瓊脂培養基 成都科龍有限責任公司;滬釀3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、滬釀3.130毛霉、AS 3.972紅曲霉 上海迪發釀造生物制品有限公司;米根霉、枯草芽孢桿菌 實驗室保藏菌種[20]。

UV-2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;LD5-10低速離心機 北京醫用離心機廠;HXD-60J高壓蒸鍋 中山市奧尼亞電器有限公司;KXB-12AN恒溫培養箱 成都科析儀器成套公司;HWS-150恒溫恒濕培養箱 北京中興公司;HSQ-I恒溫水浴鍋 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃豆醬制曲、發酵工藝

浸泡:將顆粒飽滿無蟲害的黃豆洗凈,放入容器內浸泡,黃豆與水質量比為1∶3,浸泡8 h左右瀝干備用。蒸煮:浸泡后的黃豆高壓蒸鍋蒸煮25 min,將其冷卻到50 ℃。混合:冷卻后的黃豆與面粉混合,黃豆與面粉質量比為1∶3.5。接種:待黃豆和面粉混合物溫度冷卻到40 ℃時接種菌種,接種量為1 mL/100 g大豆混合物,菌種濃度調整為106cfu/mL。成曲:曲料放入恒溫恒濕培養箱,調節溫度為30 ℃、濕度60%,滬釀3.042米曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、滬釀3.130毛霉、AS 3.972紅曲霉、米根霉和枯草芽孢桿菌制曲72 h,AS 3.35黑曲霉制曲48 h。發酵:將成曲與14%濃度鹽水按照質量比1∶1混合,放入恒溫恒濕培養箱,調節溫度40 ℃、濕度60%。

1.2.2 制曲過程中各菌種產酶活性的研究 黃豆和面粉混合物分別接種7種菌種,在制曲過程中每隔12 h測定黃豆曲中蛋白酶活力、淀粉酶活力和糖化酶活力,研究各菌種在制曲過程中的酶活表現。

1.2.3 菌種接種方式的研究 單菌種制曲發酵:黃豆和面粉混合物分別接種7種菌種,將成曲按照表1中單菌種序號進行標號,發酵7 d后測定醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量。

曲料混合發酵:黃豆和面粉混合物分別接種7種菌種,將成曲按照表1中2菌種、3菌種、4菌種、5菌種、6菌種和7菌種組合混合(每種成曲混合比例均等)且標號,發酵7 d后測定醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量。

多菌種混合制曲發酵:菌種按照表1中2菌種、3菌種、4菌種、5菌種、6菌種和7菌種組合制備菌種混合液(每種菌種混合比例均等),黃豆和面粉混合物接種菌種混合液制作成曲,發酵7 d后測定醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量。

表1 菌種復合一覽表Table 1 Lists of compound strains

1.2.4 蛋白酶活力的測定

1.2.4.1 標準曲線的繪制 根據GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》[21]進行測定。蛋白酶活力指在40 ℃,pH7.2條件下,1 mL發酵水提液在1 min內水解酪蛋白產生l μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位U(U/mL)。

向試管中分別加入濃度為0、20、40、60、80和100 μg/mL酪氨酸溶液1 mL(3個平行),接著加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL和稀釋福林酚試劑1 mL(稀釋福林酚試劑:加2倍蒸餾水稀釋),搖勻后置于40 ℃保溫發色20 min,在660 nm波長下測定OD值,測定3次取其平均值,蒸餾水做空白樣。以凈OD值為縱坐標,酪氨酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線,標準曲線為:

y=0.0080x+0.0078(R2=0.9987)

1.2.4.2 實際樣品的測定 稱取5 g醬曲(3個平行),加入蒸餾水定容至100 mL,40 ℃下100 r/min水浴浸提1 h,4000 r/min離心20 min,取上清液,用0.1 mol/L的pH7.2磷酸緩沖液稀釋2倍,即制作成粗酶液。試管內加入1 mL粗酶液,40 ℃水浴預熱2 min后加入1 mL的酪蛋白溶液(先40 ℃水浴預熱),精確保溫10 min后立即加入0.4 mo1/L三氯乙酸2 mL,終止反應,繼續置于水浴鍋中保溫20 min,使殘余蛋白質完全沉淀后,離心取其上清液備用。額外向試管中加入濾液1 mL、0.4 mo1/L碳酸鈉5 mL、稀釋后福林試劑1 mL,搖勻后于40 ℃水浴保溫發色20 min,在660 nm處進行測定其吸光值OD。空白試驗為先加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL保溫10 min后再加入1 mL酪蛋白溶液繼續保溫20 min,與樣品測定中三氯乙酸和酪蛋白溶液的添加順序相反。

式中:X表示樣品蛋白酶活力,U/mL;A表示由樣品測得OD660 nm值,由標準曲線查得的相當于酪氨酸數;4表示4 mL反應液取出1 mL測定;N表示樣品稀釋的倍數;10表示代表反應時間為10 min;W表示樣品水分含量。

1.2.5 淀粉酶活力的測定 參考趙曉娟[22]在制作苦蕎納豆醬中的淀粉酶活力測定方法。淀粉酶活力指1 g固體樣品于40 ℃,pH6.0條件下,1 min內催化水解可溶性淀粉產生1 mg還原糖的酶量定義為一個淀粉酶活力單位U(U/mL)。

取充分研細的醬曲1 g,加入質量分數為0.2%的CaCl2溶液100 mL,于40 ℃水浴1 h,充分攪拌,過濾得到樣液。在燒杯中加入1 mL樣液和pH6.0磷酸鹽緩沖液1 mL,40 ℃水浴10 min,然后加入2%的可溶性淀粉溶液1 mL,反應5 min后立即加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL。吸取上述溶液1 mL,加入DNS試劑1 mL,沸水浴5 min進行還原反應,顯色后迅速冷卻,定容于15 mL,于540 nm處測定吸光值OD。以蒸餾水替代樣液進行空白測定。

式中:X表示樣品淀粉酶活力,U/mL;A表示凈吸光度(樣品與空白吸光度之差);8表示樣液共8 mL;W表示樣品水分含量。

1.2.6 糖化酶活力的測定 根據GB 1886.174-2016《食品添加劑 食品工業用酶制劑》[23]進行測定。糖化酶活力指1.0 g固態發酵產物在40 ℃、pH4.6條件下,1 h分解可溶性淀粉產生1.0 mg葡萄糖,即為1個酶活力單位,U/g。

粗酶液制備:稱取5.0 g醬曲,加90 mL水和10 mL pH4.6乙酸—乙酸鈉緩沖液,搖勻,40 ℃恒溫水浴1 h,每隔l0 min左右震蕩一次。用四層紗布過濾,濾液稀釋到適當倍數測定。

樣品測定:取A、B兩個容量品,分別加入2%可溶性淀粉溶液25 mL和pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液5 mL,充分搖勻,在40 ℃水浴鍋中預熱5 min。在A管中加入粗酶液2 mL,B管加入200 g/L氫氧化鈉溶液0.2 mL,搖勻,在此溫度下準確反應30 min后,立即向A管中加入200 g/L氫氧化鈉溶液0.2 mL,向B管中補充粗酶液2 mL,搖勻,迅速冷卻。吸取A、B管中的反應液和空白液5 mL于100 mL燒杯中,準確加入0.1 mol/L碘溶液10 mL,再加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液15 mL,搖勻,并于暗處放置反應15 min,取出,加入2 mo1/L硫酸溶液2 mL,用0.05 mo1/L的硫代硫酸鈉溶液滴定至剛好無色。

式中:X表示樣品的糖化酶活力,U/mL;VB表示空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL;VA表示樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積,mL;c表示硫代硫酸鈉溶液的濃度,mol/L;90.05表示與1.00 mL硫代硫酸鈉溶液相當的以克表示的葡萄糖的質量;32.2表示反應液總體積,mL;5表示吸取反應液的體積,mL;1/2表示吸取濾液2.00 mL,以1.00 mL計;n表示稀釋倍數;2表示反應30 min,換算成1 h的酶活力系數。

1.2.7 氨基酸態氮含量測定 根據GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》[24]進行測定。

1.3 數據處理

實驗平行組為3組,采用SPSS 18.0軟件進行數據處理和分析,采用Origin 9.0軟件進行數據圖的制作。

2 結果與分析

2.1 制曲過程中各菌種產酶活性的變化

由圖1可以看出,酶活總體變化趨勢隨著制曲時間的增加逐漸增高,在制曲72 h后上升趨勢變緩或者有下降趨勢,與菌種在培養基中產酶變化一致,7種菌種在制曲環境中適應性強,菌種種類不同產酶活性差異較大。蛋白酶活力在制曲36 h后上升趨勢明顯,72 h后上升趨勢減緩,在制曲72 h時,滬釀3.042米曲霉產蛋白酶活力(1470 U/mL)和枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力(892 U/mL)較高;各菌種產淀粉酶活力差異較大,AS 3.324甘薯曲霉和AS 3.35黑曲霉產酶活性上升趨勢明顯,在72 h后趨于平穩,最高分別可達857和784 U/mL;AS 3.35黑曲霉產糖化酶活性最突出,在48 h后上升趨勢變緩,最高可達1486 U/mL。在制曲過程中,黃豆和面粉為微生物分解的主要原料,其中大豆蛋白質含量最多,蛋白酶可將其水解成低分子蛋白胨、多肽及氨基酸等,為后續醬醪的發酵提供了充足的碳源、氮源,也使得黃豆醬含有種類豐富的氨基酸,促進其營養豐富、味道鮮美。因此,蛋白酶作用對大豆蛋白質分解至關重要,增加蛋白酶活力更有利于黃豆醬品質的保證。

圖1 制曲過程中酶活的變化Fig.1 Changes in enzyme activity during koji-making

2.2 單菌種制曲發酵對黃豆醬品質的影響

黃豆在發酵過程中,蛋白類物質水解產生游離氨基酸,氨基酸是重要的呈味物質,與黃豆醬特殊風味的生成有密切關系,是能夠決定黃豆醬品質的重要因素,氨基酸含量越高黃豆醬滋味越濃郁。游離氨基酸的含量可由氨基酸態氮含量表示,能夠反映出黃豆醬發酵成熟度[25-26]。成曲添加14%的鹽水按料液比1∶1混合,40 ℃發酵7 d后,醬醪中蛋白酶活力較成曲有所下降,在鹽水的作用下,微生物生長變緩,菌種產酶能力下降,酶活降低,發酵環境pH逐漸降低,中性蛋白酶活力降低,總體蛋白酶活力降低,其中滬釀3.042米曲霉蛋白酶活力最高(580 U/mL)。發酵7 d后醬醪中氨基酸態氮含量均超過GB/T 24399-2009《黃豆醬》[27]規定標準0.5 g/100 g,此時醬醪中肽類物質被充分分解為氨基酸,可保證醬醪中呈味物質的含量,其中滬釀3.042米曲霉醬醪中氨基酸態氮含量最高(0.85 g/100 g)。

2.3 曲料混合發酵對黃豆醬品質的影響

黃豆醬成曲按照表1混合后發酵7 d,測定其蛋白酶活力和氨基酸態氮含量。由圖3可知,2菌種和3菌種混合時較其它組合混合產生的蛋白酶活力平均值較高,超過單菌種最大酶活(米曲霉產蛋白酶活力580 U/mL)的組合數多,不同成曲的混合對黃豆醬發酵過程中產蛋白酶活力影響較大。在2菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大酶活的組合占2菌種總數的33.3%,其中17號酶活最高(662 U/mL);在3菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大酶活組合占3菌種總數的85.7%,其中5號蛋白酶活力(793 U/mL)最高,貢漢坤[28]在研究傳統豆醬發酵工藝時發現米曲霉、醬油曲霉、黑曲霉分開制曲后混合發酵得到的醬醪酶系豐富,3菌種成曲混合發酵增加了酶活力。在4菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大酶活的組合占4菌種總數的20%,其中5號蛋白酶活力最高(700 U/mL);5菌種、6菌種和7菌種蛋白酶活力效果不顯著,均低于單菌種最大酶活。

圖3 曲料混合發酵對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effects of mixed koji cultures on protease activity

從圖4可知,醬醪在發酵7 d后氨基酸態氮含量基本超過國家標準(0.5 g/100 g),2菌種和3菌種混合對氨基酸態氮含量影響最明顯,氨基酸態氮含量平均值較高且超過單菌種最大氨基酸態氮含量(米曲霉產氨基酸態氮含量0.75 g/100 g)的組合數多,4菌種、5菌種、6菌種和7菌種氨基酸態氮含量平均值較低。在2菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大氨基酸態氮含量的組合占2菌種總數的57.1%,其中5號含量最高(0.94 g/100 g);在3菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大氨基酸態氮含量的組合占3菌種總數的94.3%,其中4號(1.21 g/100 g)和5號(1.05 g/100 g)均超過1.0 g/100 g,米曲霉和黑曲霉復合有利于氨基酸態氮的生成,由于米曲霉產中性蛋白酶分解蛋白質為肽類,黑曲霉產酸性蛋白酶分解肽類為氨基酸,兩者復合促進黃豆醬品質的提升。在4菌種曲料混合發酵中,超過單菌種最大氨基酸態氮含量組合占比為22.9%,其中4號氨基酸態氮含量最高(0.81 g/100 g);5菌種、6菌種和7菌種基本未超過單菌種最大氨基酸態氮含量。由此可見,混合的菌種數對曲料混合發酵中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量的影響顯著,菌種數越多對蛋白酶活力和氨基酸態氮含量的產生有一定的抑制作用,菌種數在3種組合時能最大效果促進產生蛋白酶活力和氨基酸態氮含量。

圖4 曲料混合發酵對氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Effects of mixed koji cultures on amino nitrogen content

2.4 多菌種混合制曲發酵對黃豆醬品質的影響

由圖5可知,2菌種和3菌種混合時較其它組合混合產生的蛋白酶活力平均值較高且超過單菌種最大酶活的組合數多,4菌種、5菌種、6菌種和7菌種均未超過單菌種最大酶活,菌種混合制曲時,菌種間的拮抗作用阻礙了菌種的生長,導致醬醪中酶系的不均衡和酶活偏低現象。在2菌種混合制曲發酵中,14.3%組合超過單菌種最大酶活,其中1號酶活最高(667 U/mL),李志江等[29]對比研究單一米曲霉制曲和米曲霉、黑曲霉混合菌液制曲,雙菌種制曲提高了豆醬中酶系的活性,但缺少其他微生物菌種組合制曲對酶活的影響;在3菌種混合制曲發酵中,25.7%組合超過單菌種最大酶活,其中5號(713 U/mL)蛋白酶活力較高,林汲等[30]在研究米曲霉、黑曲霉、甘薯曲霉復合菌制曲發酵得到的成曲液化力以及蛋白活力有所提高,3菌種混合產酶效果明顯。4菌種、5菌種、6菌種和7菌種產蛋白酶活力不顯著,均低于單菌種最大酶活。

圖5 多菌種混合制曲發酵對蛋白酶活力的影響Fig.5 Effects of koji containingmixed strains on protease activity

從圖6可知,醬醪在發酵7 d后氨基酸態氮含量基本超過國家標準(0.5 g/100 g),2菌種和3菌種混合對氨基酸態氮含量影響最明顯,氨基酸態氮含量平均值較高且超過單菌種最大氨基酸態氮含量的組合數多,4菌種、5菌種、6菌種和7菌種平均值較低且均低于單菌種最大氨基酸態氮含量。在2菌種混合制曲發酵中,14.3%組合超過單菌種最大氨基酸態氮含量,其中2號含量最高(0.80 g/100 g);在3菌種混合制曲發酵中,28.6%組合超過單菌種最大氨基酸態氮含量,其中 5號(0.89 g/100 g)含量最高。

圖6 多菌種混合制曲發酵對氨基酸態氮含量的影響Fig.6 Effects of koji containing mixedstrains on amino nitrogen content

通過圖2～圖6的對比分析,單菌種制曲發酵、曲料混合發酵和多菌種混合制曲發酵三種發酵方式中,單菌種制曲發酵由于酶系的單一性和較低的酶活,醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量較低;曲料混合發酵從蛋白酶活力和氨基酸態氮含量平均值以及超過單菌種最高值的組數來看,顯著優于多菌種混合制曲發酵,與制曲過程中微生物的協同作用和醬醪中酶系疊加作用相關聯,多菌種混合制曲發酵中由于多菌種間的不和諧生長和環境變化引起的反饋,造成微生物產酶能力和酶活作用受阻,導致蛋白酶活力和氨基酸態氮含量較低。

曲料混合發酵和多菌種混合制曲發酵做進一步對比,兩種發酵方式中2菌種和3菌種蛋白酶活力和氨基酸態氮含量平均值以及超過單菌種最高值的組數較多,3菌種組合最為突出,其中5號(滬釀3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢桿菌)產蛋白酶活力和氨基酸態氮含量最佳,米曲霉產蛋白酶活力最高,枯草芽孢桿菌以分泌蛋白酶為主,可將蛋白質分解為多肽類物質,黑曲霉可分泌的酸性蛋白酶將多肽分解為氨基酸促進氨基酸態氮含量的提高。

3 結論

對比單菌種制曲發酵、曲料混合發酵和多菌種混合制曲發酵,多菌種較單菌種制作黃豆醬優越性更突出,其中曲料混合發酵更適宜用于黃豆醬的生產。當曲料混合發酵采用3菌種5號組合滬釀3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢桿菌成曲按照1∶1∶1比例混合后,與14%濃度鹽水按質量比1∶1混合,在溫度40 ℃、濕度60%環境下發酵7 d后可得到蛋白酶活力為793 U/mL、氨基酸態氮含量為1.05 g/100 g的黃豆醬醬醪,高蛋白酶活力和高氨基酸態氮含量是生產優質黃豆醬的重要基礎。枯草芽孢桿菌運用于黃豆醬制曲發酵過程中,表現出較高的蛋白酶活力,利于制作高質量黃豆醬,但枯草芽孢桿菌在后期發酵階段作用還需進一步研究。比較多種菌種接種方式對黃豆醬發酵的影響,提高醬醪中蛋白酶活力和氨基酸態氮含量,對進一步改進黃豆醬生產工藝、提高黃豆醬品質有重要意義,為豆類發酵制品提供研究基礎。