巨大芽孢桿菌LB01對采后芒果炭疽病菌的抑制機制初探

丁從文,馮 群,李春煥

(1.桂西區域生態環境分析和污染控制重點試驗室,廣西百色 533000; 2.百色學院化學與環境工程學院,廣西百色 533000)

芒果營養成分豐富,不僅富含膳食纖維和維生素C,還含有高含量的維生素A前體β-胡蘿卜素和和類胡蘿卜素[1]。芒果炭疽病是影響芒果營養、品質及市場價值的重要采后病害[2]。目前,芒果炭疽病控制仍然依賴于化學殺菌劑,但長期使用會造成病原抗藥、環境污染和健康風險[3]。利用細菌、酵母菌等微生物防治作為可以替代化學殺菌劑防治的新手段已被廣泛研究[4-5]。

拮抗細菌已被發現可有效控制果蔬采后病害[6-9]。芽孢桿菌屬(Bacillus)是常見的拮抗細菌屬,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)是芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個種,許多研究表明巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)對一些食品病原菌,如魔芋軟腐病菌,青枯雷爾氏菌,番茄灰霉病原菌,香蕉灰斑病菌,花生黃曲霉菌等均有一定抑制作用[10-14]。

本文將首次研究源于百色巖溶區的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01對采后芒果炭疽病菌的抑制作用,并著重闡明其對采后芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌機制,為巨大芽孢桿菌菌株發酵液防治采后芒果炭疽病菌的作用機理的進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)菌株 百色市凌云縣巖溶區芒果園根際土壤,分離鑒定后保存于桂西區域生態環境分析與污染控制重點實驗室芽孢桿菌菌株儲藏室(菌株編號為LB01);炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides) 百色學院大型真菌研發中心提供;七至八成熟“金煌”芒果 百色市凌云縣巖溶區芒果實驗果園;PI(碘化丙啶)、DCHF-DA(2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯)、MitoTracker? Orange CMTMRos生物染色劑(BS) 上海恒遠生物科技有限公司;DMSO(二甲基亞砜)、TBA(硫代巴比妥酸) 分析純(AR)濟南恒化科技有限公司。

MF20-3微孔膜過濾器 海寧市中力過濾設備廠;Countess II FL全自動細胞計數儀 英濰捷基(上海)貿易有限公司;FYL-YS-280L中型恒溫冷藏箱 北京福意電器有限公司;WDZX-300KC臥式壓力蒸汽滅菌鍋 廣州瑞豐實驗設備有限公司;OLB-211B恒溫搖床振蕩器 濟南來寶實驗室設備有限公司;TGL-16M高速冷凍離心機 上海聚萊實驗儀器有限公司;Axioskop 40蔡司熒光顯微鏡、Axiocam MRC 10數碼相機 德國奧伯科興卡爾蔡司公司;V-1200分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芒果果實的處理 芒果果實未受到任何損傷與感染,根據芒果果實的體積大小進行分類,然后采用1%(v/v)的NaClO溶液對選擇好的芒果進行表面消毒2 min,利用無菌蒸餾水進行洗滌,使用前于通風處進行風干。

1.2.2 培養基的配制 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養基及溶菌酶肉湯(LB)培養基配方見《微生物學實驗技術》[15]。

1.2.3 巨大芽孢桿菌LB01菌株發液的制備 菌株LB01經活化后倒入LB液體培養基中,以180 r/min的轉速于搖床上36 ℃恒溫培養48 h,收集菌株發酵液,11000×g離心6 min后,取上清液經孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,收集無菌發酵濾液置于0～4 ℃冰箱儲存備用。

1.2.4 炭疽病菌孢子懸浮液的制備 將炭疽病菌(C.gloeosporioides)于PDA培養基25 ℃培養7～14 d,采用無菌去離子水沖洗培養物,用無菌玻璃棒摩擦孢子,再經雙層紗布過濾,孢子懸浮液用1～4 mL無菌去離子水稀釋并借助細胞計數儀調節濃度至1.0×104conidia/mL。

1.2.5 巨大芽孢桿菌LB01菌株對采后芒果發病率及病斑擴展的影響 參考李春玲等[16]報道的測定方法,采用一枚無菌針于芒果果實腰部產生直徑為4.0 mm、深度為2.5 mm的傷口,然后將其浸在1.5 L LB01菌株發酵濾液中,等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作為對照。50 min后取出芒果,于通風處自然風干2 h后,于每個芒果果實的傷口中心注入3 μL炭疽病菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL),所有供試芒果均在25 ℃恒溫儲存。儲存0、7和10 d測定LB01菌株發酵濾液對芒果果實的發病率及病斑直徑的影響。每處理15個芒果果實,重復3次,整個實驗重復2次。

1.2.6 巨大芽孢桿菌LB01菌株對菌絲生長的影響 采用文獻[17]報道的測定方法,將3.0 μL LB01菌株發酵濾液加到80 mL熔化的PDA培養基中配成含藥培養基,用無菌打孔器(d=5 mm)在生長8 d的菌落邊沿打孔,然后將菌餅接種于含藥培養基中央,用保鮮保濕膜密封并于25 ℃恒溫培育24、36、48、72、96和120 h。用無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作為對照。測定LB01菌株發酵濾液對芒果炭疽病菌菌絲生長的抑制作用。每次處理重復3次,整個實驗重復2次。

1.2.7 巨大芽孢桿菌LB01菌株對孢子萌發及芽管伸長的影響 根據文獻[13]描述的測定方法,將100 μL孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)、1.2 mL PDB培養基和3.0 μL LB01菌株發酵濾液加到2.5 mL離心管中。取150 μL混合液均勻涂在載玻片上,然后將其置于底部鋪有圓形濕潤濾紙的培養皿中,于25 ℃恒溫培育6、8、10和12 h。用無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作為對照。測定LB01菌株發酵濾液對芒果炭疽病菌孢子萌發及芽管伸長的抑制作用。每次處理至少檢查300個孢子,每個處理均重復3次,整個實驗重復2次。

1.2.8 巨大芽孢桿菌LB01菌株對活性氧(ROS)水平的影響 根據Shi等[18]報道的ROS水平的測定方法,采用氧化劑敏感探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCHF-DA)測定炭疽菌細胞內活性氧(ROS)水平。將300 μL炭疽菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株發酵濾液的PDB培養基中,恒溫搖床(25 ℃,200 r/min)振蕩培養,用無菌蒸餾水代替B01菌株發酵濾液作為對照。分別于6、12和18 h后取出10 μL孢子液于0～4 ℃離心(5000 r/min)10 min,采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)洗滌,并在含有10 μmol/L DCHF-DA(溶于二甲基亞砜)的相同緩沖液中避光孵育5 min。于蔡司熒光顯微鏡下觀察,并計算每次處理中被DCHF-DA染色的孢子細胞百分比(%)。每個處理重復兩次,整個實驗重復3次。

1.2.9 巨大芽孢桿菌LB01菌株對丙二醛(MDA)含量的影響 根據Wang 等[19]報道的MDA含量的測定方法,將30 μL炭疽病菌的孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到100 mL PDB培養基中,混勻后于25 ℃以200 r/min的轉速在搖床上培養3 d后收集菌絲體。取2 g菌絲體置于含有100 mL PDB培養基的錐形瓶中,加入30 μL LB01菌株發酵濾液,混勻后于200 r/min 25 ℃恒溫搖床離心培養0、6、12和18 h,吸取上清液1 mL加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,混勻后于95 ℃恒溫加熱20 min,迅速于冰浴上冷卻5 min,然后12000×g離心10 min,于600和532 nm波長下測定吸光度。等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作對照。每個處理有3次重復,整個實驗重復2次。按照下列公式算出MDA濃度C(nmol/mL),再換算出單位質量菌絲中MDA含量(nmol/mg)。

式中:C表示根據吸光度值計算出的溶液摩爾濃度,nmol/mL;A532和A600分別表示樣品中MDA-TBA反應產物在532和600 nm波長處的吸光度值;E表示樣品中MDA-TBA反應產物的消光系數,mmol/cm;L表示比色皿厚度,cm。

1.2.10 巨大芽孢桿菌LB01菌株對線粒體分布的影響 采用Shi等[18]報道的線粒體分布的測定方法,檢測LB01菌株發酵濾液對炭疽病菌孢子中線粒體分布的影響。將300 μL炭疽病菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株發酵濾液的PDB培養基中,恒溫搖床(25 ℃,200 r/min)培養,用等體積無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作為對照。25 ℃培養2、6、12和18 h后取出15 μL孢子液,加入0.1 μL線粒體選擇性染色劑(MitoTracker? Orange CMTMRos),對孢子線粒體染色5 min,采用蔡司熒光顯微鏡觀察拍照,每次處理至少檢查20 個孢子,重復3次。

1.2.11 巨大芽孢桿菌LB01菌株對細胞膜完整性的影響 采用黃云坡等[20]報道的細胞膜完整性的測定方法,將200 μL炭疽菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到2 mL含有3.0 μL LB01菌株發酵濾液的PDB培養基中,恒溫搖床(27 ℃,190 r/min)振蕩培養(用等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發酵濾液作為對照),分別于6、12和18 h后取出15 μL孢子液于4 ℃離心(5000 r/min)15 min,采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)洗滌2 次,加入10 μmol/L碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色劑進行染色,通過蔡司熒光顯微鏡觀察,采用數碼相機拍照。每個樣本隨機選取3個視野,并將亮場中的孢子數定義為總數。每個處理重復3次,整個實驗重復2次。膜完整性(Membrane integrity,MI)用以下公式計算。

式中:MI表示孢子細胞膜完整性,%;Fn表示熒光場中的孢子數;Bn表示明亮場中的孢子數。

1.3 數據處理

所有統計學分析軟件均使用SPSS 11.5版(SPSS公司,美國芝加哥)進行,通過單因素方差(ANOVA)進行分析。平均值偏離數由Duncan的多范圍測試進行。相關生化指標測定值的差異分別被界定為顯著性差異(P<0.05)與極顯著性差異(P<0.01)。

2 結果和分析

2.1 巨大芽孢桿菌LB01菌株對采后芒果發病率及病斑擴展的影響

由圖1A可知,接種后儲存7和10 d,對照組芒果果實發病程度嚴重,而LB01菌株發酵濾液處理7和10 d后芒果果實發病程度輕微;由圖1B可知,接種后儲存7 d時,對照組芒果果實已完全發病,而LB01菌株發酵濾液處理7 d后芒果果實發病率僅為46.8%;由圖1C可知,接種后儲存7、10 d時,對照組芒果果實病斑直徑分別擴展至28.33和66 mm,而LB01菌株發酵濾液處理7和10 d后芒果果實病斑直徑分別僅為5.67和15 mm,病斑直徑分別減少79.98%和77.12%。由此可見,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發酵濾液能顯著抑制采后芒果發病率及病斑擴展。

圖1 B. megaterium LB01的體內抑菌效應Fig.1 Anti-fungal effect of B. megaterium LB01 against C. gloeosporioides in vivo注:A.芒果果實炭疽病的癥狀;B.芒果發病率隨處理時間的改變情況;C.芒果病斑直徑隨處理時間的改變狀況;**表示同一時間點對照組與處理組測定值存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 巨大芽孢桿菌LB01菌株對菌絲生長及孢子萌發的影響

如圖2A所示,培養120 h,對照組炭病疽菌菌絲顏色仍然保持白色,而LB01菌株發酵濾液處理96 h后,菌絲顏色則已變灰;由圖2B可知,培養96 h,對照組菌落(colony diameter)直徑已達12.62 mm,而LB01菌株發酵濾液處理120 h后菌落直徑僅為8.56 mm。由此可見,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發酵濾液能顯著抑制采后芒果炭疽菌的菌絲生長。

圖2 B. megaterium LB01對炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of B. megaterium LB01 on mycelialgrowth of C. gloeosporioides in vitro注:A.炭疽病菌的體外癥狀;B.炭疽病菌的菌落直徑;**表示同一時間點對照組與處理組測定值具有極顯著差異(P<0.01)。

如圖3A所示,培養8 h,對照組已有93.31%的孢子萌發(conidial germination),而LB01菌株發酵濾液處理10 h后孢子僅有86.37%萌發;由圖3B可知,培養6 h,對照組芽管長度(germ tube length)已達121.22 μm,而LB01菌株發酵濾液處理8 h后芽管長度僅為103.16 μm。由此說明,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發酵濾液能顯著抑制采后芒果炭疽菌的孢子萌發和芽管伸長。

圖3 B. megaterium LB01對炭疽病菌孢子萌發及芽管長度的影響Fig.3 Effects of B. megaterium LB01 on spore germinationand germ tube length of C. gloeosporioides in vitro注:A.孢子萌發率;B.芽管長度;*表示同一時間點對照組與處理組測定值存在顯著差異(P<0.0 5)。

2.3 巨大芽孢桿菌LB01菌株對炭疽菌孢子ROS水平的影響

利用氧化劑敏感探針(DCFH-DA)對炭疽菌孢子細胞內活性氧(ROS)實行染色,染色率測定的結果如圖4顯示。在培養至第6和12 h后,處理組有73.24%和84.31%的孢子已被DCFH-DA染色劑染色,而對照組染色率分別僅為65.25%和72.23%,平均低于處理組測定值約10個百分點。這些數據測定結果表明,巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株發酵濾液能顯著誘導炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子內活性氧(ROS)的產生與積累。

圖4 B. megaterium LB01對炭疽病菌孢子活性氧產生的影響Fig.4 Effects of B. megaterium LB01 on the generation ofROS in spores of C. gloeosporioides注:*和**分別表示對照組與處理組測定值具有顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 巨大芽孢桿菌LB01菌株對炭疽菌MDA含量的影響

由圖5可知,接種后培養6 h后,處理組MDA含量已經高達0.78 nmol/mg,而對照組培養12 h后MDA含量僅為0.62 nmol/mg;接種后培養0 h時,對照組與處理組的MDA含量均為0.52 nmol/mg,但培養6 h時,對照組MDA含量升高至0.61 nmol/mg,而處理組MDA含量卻加速升高至0.78 nmol/mg。處理組MDA 含量的顯著升高表明細胞內部已受到ROS的嚴重氧化損傷。

圖5 B. megaterium LB01對炭疽病菌中MDA含量的影響Fig.5 Effects of B. megaterium LB01 on theMDA content of C. gloeosporioides注:*表示同一時間點對照組與處理組病原菌測定值具有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 巨大芽孢桿菌LB01菌株對炭疽菌孢子中線粒體分布的影響

采用線粒體選擇性染色劑(MitoTracker? Red CMTMRos)對病原菌孢子內線粒體進行染色,處理結果如圖6所示。對照組孢子中有大量的線粒體均勻出現在整個細胞內間隙中,發出一定強度的熒光,12、18 h后孢子熒光沒有顯著改變。但經LB01菌株發酵濾液處理12 h后,孢子熒光強度變得微弱,孢子內線粒體分布集中且不均勻,處理18 h后,處理組孢子內的熒光已經非常微弱,此刻大多數線粒體可能因降解而損壞。

圖6 B. megaterium LB01對炭疽病菌孢子中線粒體分布的影響Fig.6 Effect of B. megaterium LB01 on thedistribution of mitochondria in spores of C. gloeosporioides注:孢子于25 ℃培養,棒子表示10 μm。

2.6 巨大芽孢桿菌LB01菌株對炭疽菌孢子膜完整性的影響

基于圖7A中的碘化丙啶(PI)對孢子的染色結果,可以斷定,經B.megateriumLB01菌株發酵濾液處理的孢子細胞膜完整性(membrane integrity)受到嚴重破壞,PI染色率顯著高于對照組;由圖7B可知,培養6、12和18 h后,對照組孢子細胞膜完整性分別已達98.32%、84.23%和65.34%,而LB01菌株發酵濾液處理6、12和18 h后孢子細胞膜完整性分別僅為73.21%、68.31%和43.18%。由此說明,B.megateriumLB01對炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子細胞膜具有顯著的破壞作用。

圖7 B. megaterium LB01對炭疽病菌孢子細胞膜完整性的影響Fig.7 Effects of B. megaterium LB01 on the membrane integrity of spores of C. gloeosporioides注:*和**分別表示對照組與處理組測定值具有顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01)。

3 討論與結論

近年來,國內外許多學者研究發現一些芽孢桿菌屬細菌,如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)DGA14[21]、熒光假單胞桿菌(fluorescensMigula)A1[22]和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)LB72[23]對采后芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)均具有一定的抑制作用。但是,關于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)對芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)的抑制作用及其作用機理的報道,相關文獻極其甚少。本文研究了芽孢桿菌屬細菌巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株發酵濾液對采后芒果炭疽病菌的抑菌效果,并對其抑制作用機理進行了初步探究。

與對照組相比,處理組B.megateriumLB01對芒果采后炭疽病的發病率和發病程度均有顯著的影響,表明LB01菌株發酵濾液對采后芒果果實炭疽病具有較強的抑制效果。體外培養的C.gloeosporioides經巨大芽孢桿菌LB01的處理,C.gloeosporioides的菌絲生長、孢子萌發及芽管伸長均均受到顯著抑制。C.gloeosporioides細胞內活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及線粒體分布狀況和降解程度均是影響炭疽病原菌生長及孢子萌發的重要指標。

活性氧(ROS)能對細胞中的化合物造成氧化損傷,并導致細胞功能障礙甚至細胞死亡[24-25]。在所有細胞中,ROS的產生和清除之間存在著適當的細胞內平衡。氧化還原動態平衡要求不同細胞間反應的有效協調,并受復雜的信號傳導路徑控制[26]?；钚匝?ROS)是呼吸作用常見的產物之一,但其產生與積累至一定程度,除了可破壞細胞內平衡,還可與細胞內生物大分子(脂質、蛋白質及DNA)反應,最終導致細胞凋亡[27-28]。本研究的炭疽菌經LB01菌株發酵濾液處理6、12 h后,孢子內活性氧(ROS)水平顯著升高,說明巨大芽孢桿菌LB01菌株發酵濾液能誘導孢子內活性氧大量產生而對菌絲造成損傷直至死亡;丙二醛(MDA)是細胞內部生物大分子(如脂質)過氧化的產物,它是細胞內部生物大分子氧化損傷程度一個重要指標[29],本研究采用巨大芽孢桿菌LB01菌株發酵濾液處理6 h后,MDA含量顯著升高,此時細胞內部 MDA 的含量是對照值的1.5倍,MDA含量的顯著升高暗示病原菌菌絲細胞內部已受到嚴重的氧化損傷,最后導致細胞死亡。

因此,巨大芽孢桿菌LB01菌株發酵濾液能顯著誘導炭疽菌孢子內活性氧(ROS)的產生和積累及促進菌絲中丙二醛(MDA)含量的升高,表明菌絲和孢子細胞內脂質、DNA和蛋白質可能已經受到嚴重的氧化損傷,從而抑制病原菌孢子萌發和菌絲生長,這可能是巨大芽孢桿菌LB01抑制采后芒果炭疽病菌生長從而防治采后芒果炭疽病的機制之一。

眾所周知,線粒體是細胞三磷酸腺苷(ATP)的主要來源,在多種細胞代謝和細胞凋亡等過程中起著核心作用[30-31],本研究顯示巨大芽孢桿菌LB01菌株發酵濾液處理后炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子內線粒體熒光變暗,表明巨大芽孢桿菌LB01對線粒體具有一定的損傷作用,可能導致活性下降,對細胞正常的新陳代謝活動造成一定的影響。同時,線粒體呼吸活動也是ROS的主要內生源,ROS大量產生和積累不僅可引起線粒體DNA(mtDNA)突變、衰老和細胞凋亡[32-33],還可引起線粒體電子傳遞信息中斷,從而進一步促使線粒體內ROS的產生[34-35],二者交替進行,最后造成細胞凋亡。本研究表明,炭疽菌孢子內線粒體在經B.megateriumLB01發酵濾液處理后,熒光微弱、分布集中且嚴重降解,從而導致C.gloeosporioides孢子線粒體的氧化損傷。因此,病原菌孢子的活性氧(ROS)積累和線粒體降解可能是B.megateriumLB01抑制C.gloeosporioides生長的重要方式之一,從而抑制采后芒果果實炭疽病的發生。

在本研究中,芒果果實活體接種7和10 d后,經巨大芽孢桿菌LB01發酵濾液處理的芒果果實顏色仍呈黃色,但對照組已變為橙色,這表明巨大芽孢桿菌LB01在芒果采后衰老控制中起重要作用。相關文獻報道芒果是一種對乙烯敏感的更年期水果,在衰老過程中呼吸作用與乙烯產生均顯著增加[36],乙烯在植物種子萌發、植物生長、果實成熟、器官脫落和衰老以及抗病性等生理過程中起著重要作用[37]。本研究的巨大芽孢桿菌LB01菌株發酵濾液可能抑制了芒果果實中乙烯的產生或阻止乙烯與炭疽菌受體的結合,減少芒果腐爛,使芒果果實炭疽病的癥狀降低。而對照組芒果體內乙烯自由釋放以致芒果后熟與衰老加快。因此,延緩芒果果實衰老也可能是巨大芽孢桿菌LB01抑制采后芒果炭疽病害的另一機制。

綜上所述可以得出,本研究證實了從廣西凌云縣巖溶區芒果根邊候選土壤中分離的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發酵濾液通過直接抑制C.gloeosporioides孢子萌發和菌絲生長,從而抑制芒果采后炭疽病的發生。本研究結果為B.megateriumLB01對病原菌的抑制作用提供了一個機制框架,為芒果采后貯藏病害防治提供了一個較有前景的有效策略,為研發巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株防治采后芒果炭疽病的深層次作用機制奠定基礎。