響應面法優化產β-內酰胺酶菌Bacillus cereus B03的發酵條件

陳 成,寧喜斌,2,3,4,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306; 4.國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海),上海 201306)

《中華人民共和國藥典》對β-內酰胺酶定義為:能裂解青霉素和頭孢菌素類抗生素的β-內酰胺環,使其滅活的水解酶稱為β-內酰胺酶[1]。隨著核苷酸序列信息的增多,已鑒定的β-內酰胺酶的數量已接近指數增長,β-內酰胺酶數據庫含有超過4300種經過不同程度表征的酶[2-3]。β-內酰胺類抗生素由于藥效快、作用范圍廣、毒性低等優點,已被廣泛應用在食品加工、畜牧飼養和水產養殖等與人類生活息息相關的各個領域。β-內酰胺酶因其具有水解β-內酰胺類抗生素中β-內酰胺環的特點,不僅應用在前藥的開發與抗體定向酶前藥治療領域,也可與生物傳感器、ELISA檢測等結合檢測乳及乳制品中殘留的抗生素[4-7]。β-內酰胺酶不僅可以清除醫療器械、環境中抗生素的殘留,也用于食品(特別是乳及乳制品)、飲用水和環境中殘留抗生素的檢測,為食品安全及公眾健康提供重要的保障。

目前,國內報道的關于此類酶的培養基優化方面,都是單因素試驗和正交優化試驗的結合,還未見有關響應面法優化的報道[8-10]。響應面方法(RSM)結合了統計和數學技術,是基于經驗模型與實驗設計相關的實驗數據的擬合,通過使用從適當設計的實驗中獲得的定量數據來優化提取過程[11-12]。岳喜慶等[13]采用單因素試驗和正交試驗對霍氏腸桿菌WM1產青霉素酶的培養基條件進行了優化,得到的產酶活力最高為1.15×104U/(mL·h)。魏寶東等[8]通過單因素試驗和正交試驗優化大腸桿菌產β-內酰胺酶發酵培養基組成,β-內酰胺酶活力達到2648.95 nkat,比優化前提高了18%。國內報道的產β-內酰胺酶菌株存在產酶量較低的問題,且單因素試驗無法得知各因素之間的交互影響,正交試驗只能得到最佳因素水平組合,而響應面法則可更為合理的以有效、經濟的方式設計實驗方案,考慮實驗的隨機誤差,對實驗分析更加全面[14]。

本研究在前期菌株篩選的基礎上,結合單因素實驗、Plackett-Burman設計以及Box-Behnken中心組合試驗三種優化方法,旨在快速高效地提高菌株BacilluscereusB03的產酶能力,以期為進一步工業化開發利用性狀穩定且高產β-內酰胺酶的菌株提供借鑒,為工業生產β-內酰胺酶及其應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株BacilluscereusB03 由實驗室前期于上海市第六人民醫院(臨港地區)分離篩選所得,保存于-80 ℃冰箱;蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏 生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂及其他實驗所用試劑 均為國產分析純,國藥集團化學試劑有限公司;種子培養基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 5,調pH7.0;發酵培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,NaCl 4,MgSO4·7H2O 0.5,K2HPO4·3H2O4,調pH7.5。

GHP-9270隔水式恒溫培養箱、THZ-300恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司;DGG-9203AD型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;HWT-20C恒溫水浴箱 天津市恒奧科技發展有限公司;pH730臺式pH精密測試儀 德國WTW;TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;AL204精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;AC2-S超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 菌株活化:將在-80 ℃冰箱中甘油保藏的菌株置于冰上解凍復蘇,接種至營養肉湯培養基活化培養18～24 h,然后接種到營養瓊脂斜面培養基培養18～24 h。

液體種子培養:將活化的斜面菌種挑取一環接種于液體種子培養基中,250 mL三角瓶裝種子培養基100 mL,溫度37 ℃,160 r/min培養24 h。

搖瓶培養:250 mL三角瓶裝50 mL發酵培養基,將種子液按3%的接種量接入發酵培養基中,溫度37 ℃,180 r/min培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.2 菌體干重測量 將搖瓶發酵培養后的菌液置于離心管中,9000 r/min離心10 min后,去掉上清液,再用無菌水洗滌2～3次并離心。菌體置于105 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重稱其質量。

1.2.3β-內酰胺酶活力測定方法β-內酰胺酶粗酶液制備:搖瓶培養后的發酵液經高速離心機以9000 r/min離心10 min,所得上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,其過濾液即為無菌β-內酰胺酶粗酶液。

β-內酰胺酶活力測定:β-內酰胺酶活力測定參考《中華人民共和國藥典》(2015年第四版);1個酶活力單位定義為:在37 ℃條件下,1 mL發酵酶液每小時分解青霉素活性單位的量,用U表示[1]。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 碳源對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油為碳源,添加量為20 g/L,其他培養基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。根據選定的最佳碳源,分別以不同濃度的葡萄糖(1%、2%、3%、4%、5%)配制發酵培養基,測定碳源濃度對菌株發酵產酶的影響。

1.2.4.2 氮源對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別使用酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨、脲為氮源,添加量為20 g/L,其他培養基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。根據選定的最佳氮源,分別以不同濃度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%、5%)配制發酵培養基,測定氮源濃度對菌株發酵產酶的影響。

1.2.4.3 溫度對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別調整溫度為28、31、34、37、40、43 ℃,pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.4 發酵初始pH對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,將發酵培養基初始pH分別調整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,37 ℃、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.5 接種量對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液分別以不同的接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.6 裝液量對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 通過改變相同規格的250 mL三角瓶中的裝液量來改變溶氧濃度。將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,以初始發酵培養基為基礎,發酵瓶裝液量依次為20、30、40、50、60、70、80 mL,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.7 金屬離子對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別添加濃度為0.5 g/L的不同金屬離子(Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+),其他培養基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。根據選定的金屬離子,分別以不同濃度的MgSO4·7H2O(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)配制發酵培養基,測定金屬離子濃度對菌株發酵產酶的影響。

1.2.4.8 K2HPO4·3H2O對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別添加不同濃度的K2HPO4·3H2O(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%),其他培養基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.2.4.9 NaCl對菌株發酵產β-內酰胺酶的影響 將種子液以3%的接種量接入發酵瓶中,發酵瓶裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,以初始發酵培養基為基礎,分別添加不同濃度的NaCl(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),其他培養基成分不變,在37 ℃、pH7.5、180 r/min條件下培養40 h,測定發酵液酶活和菌體干重。

1.3 響應面試驗設計

1.3.1 Plackett-Burman設計試驗 在單因素實驗的基礎上,選取9個影響因素作為研究對象,以β-內酰胺酶酶活(Y)為響應值,進行試驗次數N=12的Plackett-Burman(PB)設計,P-B試驗設計的因素與水平見表1。每個因素分別取低(-1)和高(+1)兩個水平,另設A0虛擬因素列以考察實驗誤差。

表1 Plackett-Burman設計變量Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design

1.3.2 中心組合Box-Behnken響應面實驗 利用Plackett-Burman設計實驗篩選出三個顯著性因素,即溫度(A)、pH(B)、接種量(C)。采用Box-Behnken中心組合設計,以溫度(A)、pH(B)、接種量(C)為自變量,以酶活力(Y)為響應值設計3因素3水平試驗,中心組合試驗方案中的因素及水平如表2所示,數據用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析[15-16]。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.4 數據處理

本實驗用GraphPad軟件進行單因素實驗數據分析和制圖,利用Minitab 17軟件設計Plackett-Burman實驗和分析實驗數據。利用Design-Expert 8.0.6軟件設計中心組合Box-Behnken響應面實驗和分析結果。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 最佳碳源的確定 如圖1所示,當葡萄糖作為唯一碳源時,菌株B03產β-內酰胺酶的酶活最高,乳糖次之,蔗糖作為碳源時,酶活最低。菌體干重大小也與各個碳源酶活的高低基本呈正比變化。隨著葡萄糖含量的增加,當葡萄糖含量為2%時,產酶活力最高,進一步提高葡萄糖濃度酶活力下降。葡萄糖含量為4%時,菌體干重雖然達到最大值,但酶活不高,故選擇含量為2%的葡萄糖作最適碳源,即20 g/L。

圖1 不同的碳源及葡萄糖濃度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources and glucoseconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase注:不同小寫字母表示同一指標不同組間差異顯著(P<0.05);圖2～圖9同。

2.1.2 最佳氮源的確定 如圖2所示,當有機氮(如蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏)作氮源時,菌株B03產酶量整體高于無機氮(如硫酸銨、脲)作氮源時的產酶量。有機氮作氮源時較無機氮作氮源時的菌株產酶量不僅存在顯著性差異(P<0.05),且其菌體干重較無機氮源的菌體干重也存在顯著性差異(P<0.05),說明有機氮源比無機氮源更適合菌體生長。當使用酵母浸粉作為氮源時,菌株產酶活力最高且菌體干重最大。隨著酵母浸粉含量的增加,當酵母浸粉含量為2%時,產酶活力最高,進一步提高酵母浸粉濃度酶活力下降。酵母浸粉含量為3%時,菌體干重雖然達到最大值,但酶活已處下降趨勢,故選擇含量為2%的酵母浸粉作最適氮源,即20 g/L。

圖2 不同的氮源及酵母浸粉濃度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sourcesand yeast extract concentrations on dry cellweight and activity of β-lactamase

2.1.3 最佳溫度的確定 如圖3所示,隨著溫度的升高菌體干重及酶活都呈先增長后下降的趨勢。當溫度為28～37 ℃時,酶活及菌體干重呈上升的趨勢;當溫度為37 ℃時,酶活力最高,菌體干重也達到最大;當溫度大于37 ℃時,酶活呈直線下降的趨勢。因此,確定37 ℃為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳發酵溫度。

圖3 溫度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.4 最佳pH的確定 如圖4所示,培養基初始pH為7.0時,酶活力最高,菌體干重也達到最大,對菌株B03產β-內酰胺酶最有利。過酸和過堿都會影響菌體的增長及菌株產酶的能力。因此,確定pH7.0為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳pH。

圖4 pH對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.5 最佳接種量的確定 如圖5所示,當接種量為1%～3%時,菌體大量增殖,酶活力也呈直線上升,3%時酶活達到最大。隨著接種量的增加,在4%時菌體干重達到最大,但由于培養基內營養物質的過度消耗影響了菌株的產酶能力,導致酶活力下降。因此,確定3%為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳接種量。

圖5 接種量對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.5 Effects of inoculum on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.6 最佳裝液量的確定 如圖6所示,裝液量的多少主要影響菌株對溶氧的需求,進而影響菌株的生長及產酶能力。當裝液量為50 mL/250 mL時,菌體干重及酶活都達到最大,裝液量增加或減少,菌體干重及酶活都呈現下降的趨勢。因此,確定50 mL/250 mL為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳裝液量。

圖6 裝液量對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.6 Effects of liquid volume on dry cell weightand activity of β-lactamase

2.1.7 最佳金屬離子的確定 如圖7所示,微生物生長與生產過程中,許多金屬離子都可作為輔助因子影響微生物的生長代謝,也會影響微生物的產酶能力。從圖7可以看出,相比其他金屬離子,鎂離子對菌體生長及菌株產酶影響較大,酶活最高。因此,確定鎂離子為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳金屬離子。不同濃度的MgSO4·7H2O對菌體干重及酶活的影響不顯著,其中加入0.2 g/L的MgSO4·7H2O時有最大酶活。

圖7 不同金屬離子及MgSO4·7H2O濃度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.7 Effects of different metal ions and MgSO4·7H2Oconcentrations on dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.8 最佳K2HPO4·3H2O濃度的確定 如圖8所示,當K2HPO4·3H2O濃度為0.4%時,菌體干重及酶活都達到最大。隨著K2HPO4·3H2O濃度的加大,菌體干重及酶活呈現階梯型下降的趨勢。因此,確定0.4%為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳K2HPO4·3H2O濃度。

圖8 不同K2HPO4·3H2O濃度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.8 Effect of different K2HPO4·3H2O concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.1.9 最佳NaCl濃度的確定 如圖9所示,隨著NaCl濃度的增加,酶活基本呈曲線下降的趨勢,雖然菌體干重在NaCl濃度為0.4%時達到最大,但影響了菌株產酶能力。因此,確定0.2%為菌株B03產β-內酰胺酶的最佳NaCl濃度。

圖9 不同NaCl濃度對菌體干重及β-內酰胺酶活力的影響Fig.9 Effect of different NaCl concentrationson dry cell weight and activity of β-lactamase

2.2 Plackett-Burman設計法

在單因素試驗的基礎上,設計Plackett-Burman(N=12)實驗,對影響β-內酰胺酶發酵工藝中的9個因素的顯著性進行考察。試驗的設計及結果見表3。利用Minitab17軟件對表3數據進行主效應分析,結果見表4。從表4中可以看出顯著的三個因素為溫度、pH、接種量,P值分別為0.027、0.046、0.039均小于0.05。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman設計的各因素水平及主效應分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman design

2.3 響應面設計與結果分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設計結果與回歸模型的方差分析 以溫度(A)、pH(B)、接種量(C)為考察因素,以酶活力(Y)為響應值,進行響應面試驗設計,試驗結果見表5。利用Design Expert軟件對表5的數據進行多元回歸擬合,得到模型的二次回歸方程:

表5 Box-Behnken實驗設計表及其結果Table 5 Design and results of Box-Behnken

Y=1.122×105-711.07A+8378.41B-2287.83C-803.85AB-1484.00AC+865.68BC-13423.91A2-8353.60B2-21895.05C2。

式中:Y,β-內酰胺酶的預測活力(U/mL);A、B、C,分別代表溫度(℃)、pH和接種量(%)。

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應面曲線及等高線分析 根據Design Expert軟件分析出三種顯著影響因素溫度、初始pH、接種量的響應面和等高線結果見圖10。由各因素響應面曲線圖可知,皆呈開口向下的拋物線形狀,說明存在響應最大值。響應面曲線的陡緩程度和等高線的形狀都可以反應因素交互作用的強弱。響應面曲線走勢越陡,表明影響越顯著;響應面曲線走勢越平滑,表明影響越小。等高線呈橢圓形,表明兩因素之間有較顯著的交互作用;如果等高線呈圓形,則表明兩因素之間的交互作用不顯著[19-21]。結果表明:溫度(A)和接種量(C)交互作用對響應面值的影響顯著,溫度(A)和初始pH(B)、初始pH(B)和接種量(C)交互作用對響應值的影響不顯著。

圖10 溫度、pH、接種量交互作用對酶活力影響的響應面曲線及等高線Fig.10 Response surface plots and contour line of effects of interaction between temperature,pH and inoculum on enzyme activity

2.4 驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6分析得到影響酶活力的最佳條件理論值為溫度36.88 ℃,初始pH為7.25,接種量為2.96%,理論最高酶活力可高達114400 U/mL。考慮實際操作,調整最佳條件為溫度37 ℃,pH為7.3,接種量3%,經過3次平行試驗,測得β-內酰胺酶的平均酶活為(113278.7±1133.4) U/mL,這兩個結果之間的良好相關性證實了響應模型的有效性,表明采用響應面法優化得到的最佳條件準確可靠。在優化之前的條件下:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L、發酵溫度37 ℃、pH為7.5、接種量3%、裝液量50 mL/250 mL,該菌株產β-內酰胺酶的酶活力為88792.7 U/mL,優化之后酶活力為優化之前酶活力的1.28倍,氮源的改變顯著地提高了酶活,說明酵母浸粉更有利于該菌株產酶,其他培養基成分及發酵條件的改變也有效地提升了該菌株產酶能力。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上,利用Plackett-Burman設計篩選出溫度、pH、接種量三個顯著因素,再用Box-Behnken中心組合設計試驗確定最優產酶發酵條件。結果表明,最佳發酵培養基成分為葡萄糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO4·3H2O 4 g/L,最佳產酶發酵條件為發酵溫度37 ℃、pH為7.3、接種量3%、裝液量50 mL/250 mL。在此優化條件下,該菌株產β-內酰胺酶的酶活力為113278.7 U/mL,為優化之前酶活力(88792.7 U/mL)的1.28 倍。本研究通過響應面法優化產β-內酰胺酶細菌的發酵條件,顯著提高了產酶水平,為工業上生產β-內酰胺酶及其應用提供參考依據,為今后建立工程菌穩定的發酵工藝和規模化生產奠定了基礎。