超聲波輔助提取紫槐花色素工藝優化

徐文秀,劉 俊

(運城學院生命科學系,山西運城 044000)

紫槐,又名紅花洋槐(RobiniapseudoacaciaL.),屬豆科蝶形花亞科刺槐屬植物,為刺槐變種,因其花穗碩大,花期長而艷麗,是園林常用的觀賞樹種之一。紫槐有一定的抗旱能力,對土壤適應性強,廣泛分布于我國南北各地[1-2]。紫槐苗木主要依靠刺槐砧嫁接繁育而來,研究主要集中在嫁接技術[3-4]、組織培養及快速繁殖[5]方面。目前,對紫槐利用研究報道主要集中在紫槐葉營養成分分析及紫槐花色素提取及穩定性研究方面[6-7]。通過過前期查閱資料及預實驗結果,推測紫槐花色素屬于花青素類物質。

花青素(Anthocyanidin),又稱花色素,是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,屬類黃酮化合物。花青素是一種強有力的抗氧化劑,它能夠保護人體免受自由基的損傷。花青素還能夠增強血管彈性,改善循環系統和增進皮膚的光滑度,抑制炎癥和過敏,改善關節的柔韌性。目前,花青素含量測定方法有以下四種:單一pH法、差減法、pH示差法[8-10]和高效液相色譜法。單一pH法和差減法雖然操作簡便,但是其準確度卻比較低,目前較少使用[11-12]。高效液相色譜法適用于分析樣品中不同種類花青素的含量,準確率較高,但需要有標物才能定性樣品,而且設備和標品成本較為昂貴,限制了本方法應用[13]。同前三種方法相比,pH示差法所需設備相對簡單,準確性好,適用于對未知結構花青素類物質含量測定[14-16]。目前pH示差法已測定黑枸杞[12,14]、茄子皮[17]、紅菊苣[18]、藍莓[19]、各種顏色的花[20]、無花果皮[21]、紫蘇葉[22]等原料中花青素含量。但還未見運用pH示差法對紫槐花花青素進行測定的相關報道。

同傳統溶液提取法相比,利用超聲波技術輔助提取可以強化提取分離過程,可有效提高提取分離率,縮短提取時間、節約成本、甚至還可以提高產品的質量和產量。本研究采用超聲波輔助提取,利用pH示差法對紅花刺槐色素產量進行測定。研究紫槐花中提取色素最佳工藝,以期為紫槐花色素的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫槐花 采自運城學院校區,花苞飽滿未開放時采摘,干燥后密封包裝置于避光處保存,待用;檸檬酸 天津市瑞金特化學品有限公司;KCl 天津市瑞金特化學品有限公司;鹽酸 洛陽昊華化學試劑有限公司;NaAc 天津市大茂化學試劑廠;以上試劑均為分析純。

UV6000PC紫外可見分光光度計 西安比諾儀器設備有限公司;TP213電子天平 海舜宇恒平科學儀器有限公司;SHZ-Ⅲ循環水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫槐花色素提取工藝優化

1.2.1.1 紫槐花色素最大吸收波長的確定 準確稱取1.00 g干燥紫槐花,加入50 mL 0.1%檸檬酸溶液,60 ℃,300 W超聲波提取20 min,抽濾得濾液。用紫外可見分光光度計,在波長220～760 nm掃描,確定紫槐花色素液最大吸收波長。

1.2.1.2 最佳提取劑的確定 稱取1.0 g紫槐花6份,分別加入100 mL 0.1%檸檬酸、0.1%鹽酸、0.1%硫酸、95%酸乙醇、乙醚、石油醚,于60 ℃,300 W超聲提取20 min,抽濾得濾液,取2 mL濾液用pH=1、4.5的緩沖液分別定容至20 mL,避光靜置1 h后兩組待測液,用紫外可見分光光度計分別測其波長在在520 nm及700 nm處吸光值,計算其中色素含量,確定最佳提取溶劑。

1.2.1.3 提取溶劑最佳pH確定 精確稱取6份1 g樣品,分別加入50 mL pH=1、2、3、4、5、6的檸檬酸水溶液,用保鮮膜封口,60 ℃,300 W超聲提取20 min,抽濾得濾液,取4 mL濾液用pH=1、4.5的緩沖液分別定容至20 mL,避光靜置1 h后兩組待測液用紫外可見分光光度計分別測其波長在在520 nm及700 nm處吸光值,計算其中色素含量,確定提取溶劑最佳pH。

1.2.1.4 紫槐花色素提取單因素實驗 稱取一定量紫槐花干燥品,固定液料比50∶1 mL/g,超聲功率300 W,提取時間30 min,考察不同溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定液料比50∶1 mL/g、超聲功率300 W,提取溫度60 ℃,考察不同提取時間(5、10、15、20、25、30 min)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定提取時間30 min、提取溫度60 ℃,超聲功率300 W,考察不同液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定提取時間30 min、提取溫度60 ℃,液料比50∶1 g/mL,考察超聲功率(200、250、300、350、400、450 W)對紫槐花提取液中色素含量的影響。

1.2.1.5 紫槐花色素提取響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,選取料液比、超聲時間和超聲功率3個因素采用Box-Behnken中心試驗組合設計實驗方案,以提取液中色素含量為指標,優化提取工藝參數,實驗因素水平表如表1所示。

表1 實驗設計Table 1 Design of factors and levles

1.2.2 提取次數對色素提取的影響 稱取一定量新鮮樣品,按上述方法得到的最佳提取工藝參數超聲提取色素,提取完成后分離濾渣和提取液,濾渣再按相同條件提取,再次抽濾分離濾渣及濾液,反復4次。每次所得提取液,用pH示差法測其色素含量,確定最佳提取次數。

1.3 色素含量測定方法

經查閱文獻[20-22],色素含量采用pH示差法進行測定。具體操作如下:

pH1.0 緩沖液:配制濃度為0.2 mol/L KCl溶液;配制0.2 mol/L鹽酸溶液;以25∶76的體積比混合,再用KCl溶液調pH至1.0±0.1。

pH4.5緩沖液:配制濃度為0.2 mol/L NaAc溶液,用鹽酸調pH至4.5±0.1。

從濾液中移取2 mL待測液于20 mL比色瓶中,分別用pH=1.0、pH=4.5的緩沖溶液定容,在30 ℃水浴中反應平衡30 min。以蒸餾水作為空白對照,用紫外分光光度計測定花青素在520和700 nm處的吸光值,以矢車菊-3-葡萄糖苷計,利用Fuleki公式對待測液中花青素含量進行測定[23]。

ΔA=(A520 nm-A700 nm)pH=1.0-(A520 nm-A700 nm)pH=4.5

式(1)

式中,ΔA-紫槐花色素總吸光值;A520 nm-紫槐花色素在520 nm處的吸光值;A700 nm-紫槐花色素在700 nm處的吸光值;c-紫槐花色素質量分數(mg/100 g);V-提取液總體積(mL);DF-稀釋倍數;M-Cy-3-Glu(矢車菊-3-葡萄糖苷)的相對分子質量(449.2 g/mol);ε-Cy-3-Glu(矢車菊-3-葡萄糖苷)的消光系數(29600 L·mol-1·cm-1);m-樣品質量(g);L-光程,數值為1 cm。

1.4 紫槐花色素紅外光譜特征

色素紅外光譜特征分析采用溴化鉀壓片法。先稱取150 mg溴化鉀,將其放入瑪瑙缽中研成細粉末。再稱取1.5 mg紫槐色素純品粉末加入其中研磨,使二者充分混勻磨細,從而進行壓片。在400～3600 cm-1范圍內測其紅外吸收光譜,并進行分析[24]。

1.5 數據處理

為了保證實驗精確度,每個水平進行三組平行實驗,結果取平均值。采用Excel 2003軟件進行數據分析及繪圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Benhnken中心組合響應面設計及方差分析。

2 結果與分析

2.1 紫槐花色素提取液最大波長確定

根據圖1可得知,紫槐花色素液在220～760 nm波長范圍掃描時,有三個峰,分別為280、340、538 nm,其中280、538 nm峰符合花青素特征波長[24];所以可以用pH示差法對其含量進行測定。

圖1 紫槐花色素最大波長的確定Fig.1 Determination of the maximum wavelength of pigment

2.2 紫槐花色素最佳溶劑的確定

根據圖2可知,0.1%檸檬酸提取紫槐花效果最好,其次是0.1%鹽酸、95%酸乙醇、0.1%硫酸,乙醚很少溶出、石油醚基本不溶,從圖中可知用檸檬酸提取效果更好,所以后續實驗選用檸檬酸溶液做提取溶劑。

圖2 紫槐花色素最佳溶劑的確定Fig.2 Determination of the best solvent of pigment

2.3 提取溶劑最佳pH確定

根據圖3可得:檸檬酸溶劑pH對于紫槐花色素量的影響:pH<2之前呈上升狀態,pH=2時色素提取量達最大值。pH>2后色素提取量急劇下降,最后趨于平穩。由此紫槐花色素提取時,提取溶劑pH=2最佳。

圖3 紫槐花提取色素溶劑最佳pH的確定Fig.3 Determination of the best pH vaule of extraction solvent

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 提取溫度對提取液中色素含量的影響 由圖4可知:溫度低于60 ℃時,色素含量隨溫度的升高而上升,因為溫度升高,物質分子溶解和擴散的速度都會加快;溫度高于60 ℃,色素含量就會下降。這可能是溫度過高使色素降解所致[24]。

圖4 提取溫度對紫槐色素提取的影響Fig.4 Effect of temperature on pigment extraction

2.4.2 提取時間對提取液中色素含量的影響 由圖5可知,隨著提取時間的延長,色素含量上升,當提取時間為20 min時,色素含量最高,繼續延長提取時間,色素含量下降明顯;原因可能是色素在該溫度下時間過長,導致色素結構變化,失去原來的理化性質,從而使色素含量下降[24]。

圖5 提取時間對紫槐色素提取的影響Fig.5 Effect of time on pigment extraction

2.4.3 液料比對提取液中色素含量的影響 由圖6可知,色素含量會隨提取液用量增大而上升,當液料比達到50∶1 g/mL時,色素提取量最高。隨后,提取溶劑用量增加,色素提取量下降,但下降幅度不大,曲線趨于平穩,原因可能是隨著液料比的增加,紫槐花與提取溶劑的接觸面增加,色素類物質向溶劑溶出的阻力減小,使得提取液中溶解的色素含量增加;當液料比達到一定值時,色素中的有效成分基本溶出,傳質推動力減小,提取量有所降低[25]。

圖6 液料比對紫槐色素提取的影響Fig.6 Effect of liquid to materialratio on pigment extraction

2.4.4 超聲功率對提取液中色素含量的影響 由圖7可知,功率在200～300 W內,色素含量隨功率提高逐漸增大。這是因為超聲波在媒質中傳播時可產生空化現象,空化中產生的極大壓力造成被破碎物在瞬間破碎,同時,超聲波產生的振動作用加強了被破碎物的擴散及溶解。功率加大,空化及機械作用以增大物分子運動頻率和速率,從而增加溶劑穿透力,提高紫槐花色素的溶出[19]。功率大于300 W,色素含量降低。可能原因是:超聲波頻率過大,作用過程中媒質升溫過高,導致色素發生降解[22]。由此可得,超聲波提取紫槐花色素溫度最佳功率為300 W。

圖7 超聲功率對紫槐色素提取的影響Fig.7 Effect of ultrasonic wavepower on pigment extraction

2.5 響應面試驗結果與分析

根據Box-behnken組合原理設計實驗,實驗結果如表2所示。

表2 實驗結果Table 2 The result of tests

2.5.1 模型建立與顯著性分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2結果進行二次多元回歸擬合,得到的紫槐花色素提取量(Y,mg/100 g)對自變量料液比,超聲時間,超聲功率的二次多項回歸方程如下:

Y=118.25-0.47A+3.84B-14.07C+1.95AB+2.30AC-0.43BC-18.88A2-25.5B2-22.78C2

各因素方差分析如表3所示。由表可知:模型P<0.0001,表明該程模型達到極顯著水平,失擬項P=0.0739>0.05,表明該回歸模型與實驗結果吻合度高。所以,此回歸模型成立。可以分析和預測提取紫槐花色素含量的結果。超聲功率P<0.01,表明超聲功率對提取液中色素含量影響極顯著,而液料比、提取時間P>0.05,說明這兩因素對提取液中色素含量影響不顯著。各因素對紫槐色素提取影響大小依次為:超聲波功率(C)>超聲波時間(B)>液料比(A)。二次項A2、B2、C2影響極顯著。交互項影響不顯著。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

2.5.2 響應面結果分析 由圖8可得,當料液比固定時,紫槐花提取液中色素含量會隨超聲波時間的延長而不斷升高,直到20 min后色素含量開始下降;當超聲波時間固定時,在液料比<50∶1 mL/g時色素含量不斷增大,料液比>50∶1 mL/g后色素含量降低。

圖8 液料比與提取時間對紫槐花色素含量的影響Fig.8 The effect of ratio of liquid to material and extraction time on the pigment yield

通過響應面及等高線圖可以直觀的看到3個變量(液料比、提取時間、提取功率)對色素含量的影響及3個變量之間的交互作用。3個變量之間的交互作用均不顯著。通過圖8～圖10等高線圖確定液料比的最佳水平范圍為45～55 mL/g,提取時間最佳水平范圍為19～21 min提取功率最佳水平范圍為275～300 W。對回歸方程求解,得到當液料比49.72∶1 mL/g,提取時間為20.38 min,超聲功率為284.44 W時,紫槐花提取液中色素含量預測值為120.594 mg/100 g。

圖9 液料比與提取功率對紫槐花色素含量的影響Fig.9 The effect of ratio of liquid to material and ultrasonic wave power on the pigment yield

圖10 提取時間與超聲功率對紫槐花色素含量的影響Fig.10 The effect of extraction time and ultrasonic wave power on the pigment yield

2.5.3 最佳工藝平行驗證試驗 利用Design-expert軟件Box-Behnken設計原理對紫槐花色素提取條件進行正交設計,響應面法預測最佳紫槐花色素提取方案為:采用溶劑為pH=2的檸檬酸溶液,提取溫度為60 ℃,理論液料比49.72∶1 mL/g,理論提取時間為20.38 min,理論超聲功率為284.44 W。在以上條件下,紫槐花提取液中色素含量預測值為120.594 mg/100 g。采取以上理論預測的紫槐花色素提取最優條件進行實驗驗證,考慮到實際情況,將紫槐花色素提取最優條件改為液料比50∶1 mL/g,提取功率為300 W,提取時間為20 min。以上相同條件下進行3組平行實驗,測出紫槐花提取液中色素含量值,取三組平均值,為118.77 mg/100 g。結果表明:實際值與響應面優化設計的預測值相差很小,此響應面法優化紫槐花色素提取工藝條件是可行的。

2.6 提取次數對色素得率影響結果分析

根據圖11可知:隨著提取次數的增加色素提取越來越完全。經測定得出:兩次提取后,濾渣中剩余的色素含量已經較低。三次提取后,濾渣之中的色素含量已經非常少,濾渣顏色呈透明色;四次提取后,提取液中色素含量接近為0。綜上所述選取提取次數為三次最為合理。

圖11 提取次數對紫槐色素提取的影響Fig.11 Effect of extraction times on pigment

2.7 紫槐花色素紅外光譜特征分析

如圖12所示,紫槐色素紅外光譜主要波數有1143、1705、1756、3289、3496 cm-1。其中,1143 cm-1為C-O-C伸縮吸收峰,這可能是花青素結構中吡喃環的結構。1705、1756 cm-1為雜環中羰基C=O的振動吸收峰,是判斷羰基C=O(酮類、酸類、酯類、酸酐等)伸縮的特征頻率。3248、3496 cm-1為羥基O-H伸縮振動吸收峰,說明結構有醇類、酚類或者有機酸。紫槐色素主要吸收有羰基、含氧雜環、羥基等結構,因此,推測屬于花青素類物質[24]。

圖12 紅外光譜圖Fig.12 Infrared spectra of pigment

3 結論

響應面試驗確定提取紫槐花色素的最佳工藝條件:最佳提取劑為pH=2檸檬酸水溶液,液料比為50∶1 mL/g,提取溫度60 ℃,提取時間20 min,超聲功率300 W,在此條件下,提取液中色素含量為118.77 mg/100 g。影響色素提取因素的大小依次為:超聲功率>超聲時間>液料比。提取三次基本上可以將紫槐花中色素提取完全。經紫外可見光掃描最大吸收波長及紅外光譜分析,推測紫槐色素主要成分為花青素類物質。但掃描結果顯示提取物中存在黃酮類成分。深入研究紫槐花色素穩定性時需要將其中黃酮類成分去除。本研究測定色素含量時是以常見的矢車菊-3-葡萄糖苷計的,下一步研究應對紫槐花中花青素種類及糖苷中糖的種類進行深入分析,為今后更好利用紫槐花資源提供理論依據。