低溫等離子體對金黃色葡萄球菌腸毒素B的滅活作用

潘 迪,張大革,孫運金,馬挺軍

(北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206)

等離子體殺菌技術是近年來出現的一項新的物理殺菌技術,相對于其他滅菌方法,低溫等離子體的突出特點是操作溫度低、滅菌時間短、無殘留毒性,能廣泛應用于多種材料和物品的滅菌[1-2]。目前,低溫等離子體破壞細菌和真菌等微生物的機制一般認為是低溫等離子體中的帶電粒子和活性氧在滅菌過程中起主要作用,帶電粒子可擊穿細菌等微生物外部結構(細胞壁和細胞膜),而活性氧組分(單原子氧、臭氧、中性亞穩態氧分子、氫氧自由基等)可與細菌等微生物外部結構中蛋白質、核酸、脂質等大分子反應,產生刻蝕作用,破壞外部結構,導致微生物細胞質內容物的漏出,從而引起微生物死亡[3-5]。有研究表明,低溫等離子體對細菌繁殖體、細菌芽孢、毒素等都具有良好的殺滅效果[6-8]。其中,介質阻擋放電(Dielectric barrier discharge,DBD)低溫等離子體因放電面積較大、電子密度高、設備簡單、適合大規模工業應用,已成為國內外研究的熱點[9-10]。

金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)作為一種超抗原,是葡萄球菌分泌的主要外毒素,也是葡萄球菌引起的主要致炎性物質[11]。SEB分子量為28.4 kDa,包含有239個氨基酸片段,等電點為8.6,其結構主要由通過環狀結構連接的2個區域構成,具有耐高溫、酸堿和蛋白水解酶等特點,產毒量最大(500 μg/mL)[12-13]。一般情況下,人體食入0.004 μg/kg劑量就會受到嘔吐中樞的刺激而引發嘔吐、腹痛、腹瀉等臨床癥狀,而0.02 μg/kg劑量就足以致死[14],因此對SEB進行處理具有重大的現實意義。

近年來,國內外降解腸毒素的研究主要集中在酶降解或微生物降解上。Fujikaw等[15]采用從原料乳中分離的銅綠假單胞菌降解葡萄球菌腸毒素A(SEA),結果發現生乳中銅綠假單胞菌產生的蛋白酶對SEA有降解作用。吳擁軍等[16]證明了耐氧雙歧桿菌對大腸桿菌腸毒素具有生物降解作用,它可以把腸毒素(一種小分子的小肽)作為生長所需的營養物質使其分解。然而,關于物理降解腸毒素的方法鮮有報道,尤其是采用低溫等離子體物理降解SEB的研究尚未見報道。因此,本研究在大氣壓下以空氣為工作氣體,以DBD方式產生低溫等離子體,用低溫等離子體處理SEB后注射給小鼠,通過測定小鼠的存活時間、體重、抗氧化酶活性,評價低溫等離子體對金黃色葡萄球菌腸毒素B的滅活效果及其對小鼠存活時間影響的潛在機理,為今后低溫等離子體降解SEB的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品 純度100%,用于攻毒時稀釋10倍,美國Sigma公司;SPF級雌性BALB/c小鼠 6～8周齡,體重(20±2) g,50只,北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物合格證號為SCXK(京)2018-0001;ELISA試劑盒、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;Tris-HCl、EDTA-2Na 北京Solarbio公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖、氯化鈉 均為國產分析純。

介質阻擋放電低溫等離子體 北京農學院食品科學與工程學院自制;Tektronix TDS2002型示波器、Tektronix P6015a型高壓探頭(1/1000) 上海順測電子有限公司;24 mm×50 mm蓋玻片 上海睿安生物科技有限公司;LGR16-W型臺式高速冷凍離心機 北京京立離心機有限公司;(ACCULAB)ALC-2100.2型電子天平 深圳市朗普電子科技有限公司;BCD-288WSL型卡薩帝冰箱 青島海爾股份有限公司;DW-86L578J型超低溫冰箱 廣州科曉科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫等離子體的產生 采用的實驗裝置,如圖1所示。系統主要由高壓電源、放電電極和阻擋介質等組成。高壓電源的中心頻率為50 kHz,輸出的峰值電壓為3 kV;采用厚度為5 mm,直徑(Φ)為5 cm錫箔平板做電極;阻擋介質是厚度為1.5 mm,直徑(Φ)9 cm的石英玻璃;電極間氣隙5～10 mm,實驗中放電間距取8 mm。介質阻擋放電過程中的放電電壓、放電頻率的測量通過示波器和高壓探頭進行同步顯示波形和測量值。電極裝置置于超凈工作臺內,電源裝置置于超凈工作臺外。

圖1 介質阻擋放電低溫等離子體滅活SEB裝置圖Fig.1 Diagram of SEB device inactivated bydielectric barrier discharge low-temperature plasma

1.2.2 低溫等離子體處理SEB 稱取100 μg SEB溶于5 mL 0.05 mol/L PBS溶液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖溶液,pH=7.0)中,即SEB的質量濃度為20 μg/mL。用移液槍分別將50 μL的SEB溶液滴于規格為24 mm×50 mm的4片蓋玻片上。1片作為模型組不處理,3片作為處理組置于低溫等離子體發生裝置中分別處理10、20和30 min。處理完之后,分別立即用950 μL的PBS溶液將SEB溶液沖入試管中。空白對照組為PBS溶液。試驗在常壓下的空氣中進行,環境條件為室溫20 ℃,相對濕度60%,每次處理均重復三次。

1.2.3 SEB含量的測定 將ELISA試劑盒中所有試劑的溫度恢復至室溫,然后按照試劑盒的說明書在室溫下進行操作,測定低溫等離子體處理SEB后的濃度。

1.2.4 SEB休克小鼠模型的建立及其生存時間、體重的測定 將50只雌性BALB/c小鼠隨機分為5組,每組10只。一組作為空白對照組,每只腹腔注射1 mL PBS溶液;一組作為陽性組,每只腹腔注射未處理的SEB溶液1 mL(濃度為1 μg/mL);另外3組每組每只分別腹腔注射經低溫等離子體處理10、20、30 min后的SEB溶液1 mL。注射后觀察各組小鼠存活情況,記錄存活時間(總觀察時間120 h);并在24 h對每只小鼠進行稱重。

1.2.5 10%組織勻漿的制備 在120 h觀察期內,如果小鼠死亡,則立即取小鼠肝臟于-80 ℃冰箱保存;如果小鼠未死亡,則觀察期結束后立即處死小鼠,取其肝臟;然后在同一時間下制備組織勻漿液,整個操作在4 ℃條件下進行。首先,在冷室4 ℃下取小鼠肝臟組織塊于冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱0.2 g放入10 mL的小燒杯內;然后用移液器移取1.2 mL的勻漿介質(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCl,0.0001 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(冰水浴中操作);再將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,用0.6 mL勻漿介質沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,倒入勻漿管中進行充分勻漿6～8 min。將制備好的10%勻漿用4 ℃冷凍離心機3000 r/min離心10～15 min,取上清置于4 ℃冰箱保存。

1.2.6 小鼠肝臟中抗氧化指標的測定 以1.2.5制備的勻漿上清液為樣品,按照試劑盒操作測定小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-PX的活力。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 SEB含量測定

由表1可知,與陽性組相比,低溫等離子體處理SEB后,各組SEB含量顯著降低(P<0.05),處理30 min時SEB含量降解率最大,為96%。這表明等離子體對SEB具有破壞作用,破壞效果具有時間依賴性。

表1 等離子體處理前后SEB含量Table 1 The SEB content before and after plasma

2.2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響

在實驗過程中,空白對照組小鼠在觀察時間內無一例死亡,陽性組小鼠(即等離子體處理時間為0 min)腹腔注射SEB后,身體發抖,口唇發紫,活動開始減少,24 h的死亡率為100%。低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響見圖2。與陽性組相比,3個處理組小鼠平均生存時間顯著延長(P<0.05),且等離子體處理時間越長,其平均生存時間越久,分別為陽性組的2.50倍、3.33倍、5.00倍,其原因可能是等離子體產生的活性成分,如活性氧、·OH,能夠對大分子物質蛋白質、酶、核酸等產生氧化損傷和破壞[17-18],它們通過奪取SEB蛋白上氫原子,使其變性,從而降低了其含量,減少了SEB毒害作用,間接延長了小鼠的存活時間。實驗還發現,處理SEB 30 min時小鼠的平均存活時間為120 h,與空白對照組相同,這表明該組小鼠體內SEB含量與空白對照組相近,該結論與2.1中結果相符。

圖2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠生存時間的影響(n=10)Fig.2 Effects of SEB that treated with low-temperature plasmaat different times on mice survival time(n=10)注：不同字母表示數值之間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠體重的影響

小鼠體重的變化也可反映SEB的活性,從而間接反映低溫等離子體對SEB的破壞效果。由表2可知,陽性組與空白對照組相比,小鼠平均體重極顯著下降(P<0.01),并且其平均體重與開始實驗時(20±2) g相接近,這表明SEB對小鼠生長有毒害作用,抑制其體重增加。與陽性組相比,處理SEB 10、20 min組小鼠平均體重均增加,但差異不顯著(P>0.05),處理SEB 30 min組小鼠平均體重顯著增加(P<0.05),這進一步表明等離子體處理對SEB有一定破壞作用,從而降低了處理組SEB對小鼠體重增加的抑制。

表2 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠體重的影響Table 2 Effects of SEB that treated with low-temperatureplasma at different times on mice body

2.4 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性構成一級抗氧化防御系統,在生物系統的總防御機制和防御策略中起著關鍵和基礎的作用[19]。由表3可以看出,與空白對照組相比,陽性組CAT、GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05),SOD活性極顯著降低(P<0.01)。與陽性組相比,處理SEB 10 min組對CAT、SOD、GSH-Px活性均無顯著影響(P>0.05);處理SEB 20 min組對CAT、GSH-Px活性均無顯著影響(P>0.05),SOD活性顯著提高(P<0.05);處理SEB 30 min組CAT、GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),SOD活性極顯著提高(P<0.01)。由此可知,低溫等離子體處理SEB對直接注射SEB引起的機體中SOD、CAT、GSH-PX活性的降低具有緩釋作用,且具有時間依賴性。在等離子體處理SEB 3.0 min時小鼠體內CAT、SOD、GSH-Px活性均達到最大值,與陽性組相比分別增加了69.33%、74.93%、47.92%。有研究表明,SOD水平與機體衰老呈正相關,GSH-Px具有保護細胞膜作用[20-21]。本實驗結果表明,各處理組CAT、SOD、GSH-Px活性與陽性組相比均有所提高,說明低溫等離子體處理組能夠改善機體的抗氧化能力,增強免疫力和細胞穩定性,延緩衰老,進而延長小鼠的存活時間。這與包曉瑋等[21]通過提高SOD、GSH-Px的活性來延緩小鼠衰老的結果相似。且等離子體處理SEB后,小鼠平均生存時間的延長可能與其體內抗氧化酶活性的提高有關。

表3 低溫等離子體不同時間處理SEB后對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of low temperature plasma treatment with SEB on antioxidant enzyme activity in mouse

3 結論

本實驗將SEB注射小鼠建立小鼠休克模型評價低溫等離子體對SEB的滅活作用。直接注射SEB的模型小鼠出現了陽性組生存時間和平均體重低于空白對照組,小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-Px活性降低,這些變化表明SEB對小鼠機體產生了毒害作用,造成了體內組織的氧化損傷,進而縮短了小鼠的存活時間。

通過將低溫等離子體處理的SEB注射小鼠后,3個處理組小鼠的平均生存時間和平均體重與陽性組相比均有所提高,且小鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-Px活性也高于陽性組,在處理SEB 30 min時效果最顯著。以上結果綜合表明,低溫等離子體處理可以降低SEB的含量,且隨著處理時間的延長,對SEB的降解率越大,從而提高小鼠體內抗氧化酶活性,增強機體免疫力和細胞的穩定性,延緩衰老,進而延長小鼠的存活時間,且其存活時間具有處理時間依賴性。但是,到目前為止低溫等離子體破壞腸毒素B的機制尚不清楚,仍需深入探討。