多壁碳納米管凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中44種藥物殘留

蔣 湘,吳 毅,黃燕紅,劉珈伶,趙就彬

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心,廣西南寧 530001)

隨著人們生活水平的提高,雞蛋已成為餐桌上不可或缺的食物。在禽類養殖過程中,獸藥起到防治疫病的重要作用,由此造成獸藥及其代謝物在禽蛋中殘留超標的現象屢有發生。氯霉素類藥物(Chloramphenicols)能夠抑制易感細菌中的蛋白質合成,廣泛用于禽畜生產,但該類藥物在易感人群中易引起再生障礙性貧血[1],因此,在家禽產蛋期間禁止使用,我國農業部公告第235號[2]規定動物源食品不得檢出氯霉素類藥物。氟蟲腈類藥物(Fluorine nitrile)為廣譜殺蟲劑,其代謝產物有氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚和氟甲腈,代謝物毒性均強于原藥,我國農業部于2009年發布公告停止生產銷售氟蟲腈農藥[3]?？共《绢愃幬?Antiviral)是一類用于治療甲型流感病毒感染的抗病毒劑,常被非法用于養雞業[4],其對人體神經系統造成危害[5],我國農業部560號公告規定養殖業禁止使用金剛烷胺、金剛乙胺類抗病毒藥物[6]?；前奉愃幬?Sulfonamides)是一組用于治療和預防人類和動物感染的抗菌藥物,因其廣譜活性和低成本而被廣泛使用,但其在動物體內代謝緩慢,對人體易造成蓄積危害,特別是機體對抗生素的耐藥性[7-8]。我國對禽蛋中磺胺類獸藥尚未制定殘留限量值。硝基咪唑類藥物(Nitroimidazoles)是治療和控制大腸桿菌或沙門氏菌所引發疾病的抗生素,用于禽畜養殖中疾病治療與控制,因其具有潛在的致癌性和致突變性[9],我國明確該類藥物不得在動物源食品中檢出[2]。

藥物殘留分析方法主要有氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、氣相色譜-質譜聯用法[12]、高效液相-質譜聯用法[13-14],高效液相-質譜聯用法因具有高靈敏度、高選擇性而被廣泛用于藥物多殘留的分析。藥物殘留分析前處理技術主要有固相萃取[15]、多壁碳納米管[16-18]、QuEChERS技術[19-20]等。多壁碳納米管(Multi-walled carbon nano-tube,MWCNT)為新型吸附材料,由于其獨特的結構和巨大的表面積,可以作為有效的吸附劑來吸附復雜基質中的干擾物質[21]。QuEChERS(快速、簡便、便宜、有效、堅固和安全)方法在首次引入后經過分析工作者的不斷改良,已廣泛用于各種食品基質中的農藥和獸藥多殘留分析。

目前我國國家標準和行業標準中關于獸藥殘留前處理方法主要為固相萃取、液-液萃取、QuEChERS技術,并且大部分應用高效液相-串聯質譜法對各種類型的藥物殘留進行分類檢測,檢測成本高,效率低。本研究以乙腈沉淀蛋白,改良QuEChERS技術,以多壁碳納米管、十八烷基鍵合硅膠、乙二胺-N-丙基硅烷(MWCNTs-C18-PSA)3種吸附劑組合凈化樣品,建立超高效液相色譜-質譜聯用方法測定氯霉素、氟蟲腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5大類共44種藥物殘留量的高通量方法,并對82批雞蛋中藥物殘留進行快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、甲酸、甲酸銨 色譜純,德國Merck公司;實驗用水 超純水(18.2 MΩ);鹽包 無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末(4∶1,質量比),Waters公司;多壁碳納米管 MWCNTs,純度95%,長度10～30 μm,直徑10～20 nm,XFNANO公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18粉 CNW公司;標準物質:氯霉素(Chloramphenicol)、氟苯尼考(Florfenicol)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、氟蟲腈(Fipronil)、氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)、氟蟲腈砜(Fipronil-sulfone)、氟蟲腈亞砜(Fipronil-sulfide)、金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、美金剛(Memantine)、咪喹莫特(Imiquimod)、嗎啉胍(Moroxydine)、奧司他韋(Oseltamivir)、甲氧芐啶(Trimethoprim)、磺胺二甲異嘧啶(Sulfisomidine)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺吡啶(Sulfapyridine)、磺胺噻唑(Sulfathiazole)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)、磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyridazine)、磺胺惡唑(Sulfamoxol)、磺胺甲氧嘧啶(Sulfameter)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)、磺胺氯噠嗪(Sulfachloropyridazine)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(Sulfadoxine)、磺胺甲基異惡唑(Sulfamethoxazole)、磺胺異惡唑(Sulfisoxazole)、磺胺苯酰(Sulfabenzamide)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)、磺胺喹沙啉(Sulfaquinoxaline)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺吡唑(Sulfapyrazole)、羥基甲硝唑(1H-Imidazole-1-ethanol)、2-甲硝咪唑(2-Methyl-5-nitroimidazole)、羥甲基甲硝咪唑(1-Methyl-5-nitro-1H-imidazole-2-methanol)、甲硝唑(Metronidazole)、洛硝噠唑(Ronidazole)、地美硝唑(Dimetridazole)、苯硝咪唑(Benzimidazole)、異丙硝唑(Ipronidazole)、奧硝唑(Ornidazole) 純度均大于98%,德國Dr.E公司;雞蛋 來自廣西多個地市(包括南寧市、桂林市、柳州市、百色市等11個地區)共82批,所有雞蛋均取可食用部分,絞碎均質(3000 r/min,2 min)后,-20 ℃冷凍保存。

島津20A高效液相色譜儀 日本島津公司;API 4500 Q-TRAP三重四級桿串聯質譜儀 美國AB公司;OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色譜柱(2.0×100 mm,3 μm) 日本大曹三耀公司;氮吹儀 北京八方世紀公司;氮氣發生器 英國PEAK公司;高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;渦旋振蕩器 德國HEIDOLPH公司;Milli-Q超純水器 法國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取2.00 g(精確到0.01 g)混勻的蛋液于50 mL聚丙烯離心管中,加入4 mL水和10 mL乙腈,混勻后再加入鹽包,迅速振搖2 min,在4 ℃條件下離心(10000 r/min)5 min,取2.0 mL上清液,加入多壁碳納米管-固相萃取(MWCNTs-C18-PSA)組合(10 mg MWCNTs+25 mg PSA+25 mg C18),渦旋30 s后,4600 r/min離心5 min,取1.0 mL 40 ℃水浴氮吹濃縮至近干,加10%乙腈定容至1 mL,渦旋混勻,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾,取續濾液,用于測定。

1.2.2 標準溶液的配制

1.2.2.1 標準儲備液 分別稱取44種標準物質適量,用乙腈溶解并定容,配成質量濃度均為1 mg/mL的標準儲備液,于-20 ℃條件下保存,有效期一個月。

1.2.2.2 混合標準使用液 分別吸取適量(氯霉素類、氟蟲腈類、抗病毒類、磺胺類、硝基咪唑類)標準儲備液(1 mg/mL),用乙腈配成標準中間液(1 μg/mL);精密量取44種標準中間液0.1、0.5、1.0 mL分別置于10 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混勻(質量濃度分別為10、50、100 ng/mL),為標準使用液①～③,精密量取44種標準中間液1.0 mL置于10 mL離心管中,氮吹至近干,用乙腈溶解轉移至2 mL量瓶中并定容至刻度(質量濃度為500 ng/mL),為標準使用液④,于-20 ℃冰箱中保存,有效期2周。

1.2.2.3 基質混合標準工作曲線 取空白樣品10份,照1.2.1提取,得到空白基質溶液,根據實驗需要配成質量濃度為0.1、0.5、1、5、25、50、100、200 ng/mL基質混合標準工作曲線,于4 ℃條件下保存。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色譜柱(2.0 mm×100 mm,3 μm);流動相:A為0.1%甲酸水,B為0.1%甲酸甲醇;進樣量:2 μL,流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃。梯度洗脫條件:0～15.0 min,2% B→50% B;15.0～21.0 min,50% B→90% B;21.0～23.0 min,90% B;23.0～23.1 min,90% B→2% B;23.1～25.0 min,2% B。

1.2.4 質譜條件 采用ESI源,正離子、負離子同時多反應監測模式(MRM)檢測,氣簾氣壓力(CUR)241.325 kPa,正離子:噴霧電壓(IS)4500 V,離子源溫度(TEM)550 ℃,入口電壓(EP)10 V,碰撞室出口電壓(CXP)12 V;負離子:噴霧電壓(IS)-4500 V,離子源溫度(TEM)550 ℃,入口電壓(EP)-10 V,碰撞室出口電壓(CXP)-8 V。

1.3 數據處理

采用MultiQuant和Excel 2010軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

多反應監測(MRM)離子對、質譜采集參數、保留時間,見表1,其中以化合物的色譜保留時間和兩對MRM離子對進行定性,定量MRM離子對的峰面積進行定量。優化后質譜條件的正負離子模式總離子流圖如圖1所示。

續表

續表

圖1 負離子模式(A)分析7種藥物和正離子模式(B)分析37種藥物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 7 drugs in negative ion mode(A)and the 37 drugs in positive ion mode(B)注:圖中峰注釋數字與表1中各數字所代表的化合物一致。

2.2 色譜條件的優化

本研究選擇色譜柱1(OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H,2.0 mm×100 mm,3 μm)、色譜柱2(ACQUITY UPLC BEH C18,2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、色譜柱3(Thermo Hypersil GOLD,2.1 mm×100 mm,1.9 μm)和色譜柱4(Agilent SB-Aq RRHD,2.1 mm×100 mm,1.8 μm)對44種藥物進行分離。結果顯示,在相同色譜條件下,色譜柱1的響應值較高,形成的色譜峰峰形尖銳,對稱性好,分離效果較佳,雜質干擾小,對磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶三個同分異構體化合物的分離效果較其它三根色譜柱好,因此選擇色譜柱1為分析柱,具體見圖2。

圖2 磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶在相同流動相體系不同色譜柱中的色譜圖Fig.2 Chromatograms of sulfamethoxypyridazine,sulfameter and sulfamonomethoxine in different columns of the same mobile phase system

2.3 流動相的優化

2.3.1 有機相選擇 本研究中有三組同分異構體,分別為金剛乙胺和美金剛、磺胺惡唑和磺胺異惡唑、磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶,同分異構體的碎片離子質量數存在高度的一致性,因此在LC-MS/MS分析時存在互相干擾。本研究通過改變流動相組成發現,在相同梯度條件下,采用乙腈作為有機相時,洗脫能力強導致出峰較快,同分異構體無法分離,而使用甲醇為流動相時,甲醇的極性、洗脫能力弱于乙腈,同分異構體間的分離度得到改善,色譜圖見圖3。

圖3 金剛乙胺和美金剛標準溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of rimantadine and diamond standard solutions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水;峰注釋數字與表1中各數字所代表的化合物一致。

2.3.2 水相的選擇 流動相中加入酸是為了給化合物在正離子模式下更好的提供質子,為使整個分析過程中酸度保持相對穩定,故在流動相A和流動相B中均添加了甲酸。水相分別添加0.1%甲酸、5 mmol/L甲酸銨、5 mmol/L甲酸銨(0.025%甲酸)、5 mmol/L甲酸銨(0.05%甲酸)、5 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸),實驗表明,水相為0.1%甲酸溶液時,各峰型及分離度最佳。具體色譜圖見圖4。

圖4 不同流動相比例時MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram with different mobile phase proportions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸銨;C:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.025%甲酸);D:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.05%甲酸);E:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)。

2.4 樣品前處理方法優化

2.4.1 提取溶劑 雞蛋的蛋黃和蛋清都是可食用部分,由于所分析的5類化合物極性不同,在蛋黃與蛋清中的分布不同,故需將兩者混合均勻。藥物殘留分析常用溶劑包括乙腈-水-緩沖液、甲醇-水-酸、乙腈-水-酸等,乙腈對蛋白質有較強沉淀效果,故本研究比較了1.0%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、70%的乙腈提取效果,結果表明,70%乙腈提取液最澄清,且無油脂漂浮,回收率依次為70%乙腈>1%甲酸乙腈>1.0%乙酸乙腈>5%甲酸乙腈,見表2,故選擇70%乙腈作為提取溶劑,去除蛋白質等干擾物質。

表2 不同提取溶劑回收率Table 2 Recovery in different solvent

2.4.2 凈化方法 本實驗用MWCNTs、PSA、C18作為吸附劑。MWCNTs主要去除色素、糖等大分子物質,PSA可以去除酸性物質、糖類和碳水化合物,C18可以去除脂肪、油脂和非極性化合物[22]。

雞蛋中富含蛋白質和脂肪,還有核黃素,這些雜質對目標化合物的測定產生較大干擾,首先考察了MWCNTs、PSA、C18對色素的吸附效果,在2 mL提取液分別加入50 mg MWCNTs、50 mg PSA和50 mg C18,實驗表明,色素的吸附效果依次為MWCNTs>C18>PSA。由于MWCNTs的結構特性,在去除干擾物的同時也吸附目標化合物,因此本實驗以回收率作為指標對MWCNTs的用量進行考察,當MWCNTs用量為10、20、50 mg時,氟蟲腈類的回收率變化不大,氯霉素、抗病毒、磺胺、硝基咪唑類回收率隨著MWCNTs用量的增加而減小,見圖5,說明MWCNTs對目標化合物有一定的吸附作用。為除去雞蛋中的脂肪、小極性化合物及其它對目標物測定帶來干擾的物質,本實驗分別考察了MWCNTs+PSA、MWCNTs+C18、MWCNTs+PSA+C18不同組合作為凈化劑,結果表明MWCNTs+PSA+C18組合的凈化效果最佳,基質干擾較小,回收率在70%～115%,滿足檢驗要求。

圖5 不同MWCNTs用量的回收率Fig.5 Recovery rates of different MWCNTs注:圖中標注數字與表1中各數字所代表的化合物一致。

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準工作曲線 按1.2.2.3操作,結果R2為0.9909～0.9999,表明44種藥物在0.1～200 ng/mL范圍內線性良好,見表1。

2.5.2 檢出限、檢出限和定量限 基質混合標準溶液按1.2.3和1.2.4色譜和質譜條件進行測定,以濃度為X軸,峰面積為Y軸繪制標準曲線,44種藥物的相關系數均大于0.991,說明方法線性良好,結果見表1。在空白樣品中添加已知濃度的標準溶液,以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計算44種藥物的方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),LOD為0.007～0.3571 μg/kg,LOQ為0.005～1.190 μg/kg,結果見表3。

表3 44種藥物殘留加標回收、精密度及LOD、LOQ(n=6)Table 3 Recovery,precision,LOD and LOQ of 44 drug residues(n=6)

2.5.3 回收率和精密度 取2.00 g樣品,置于50 mL聚丙烯離心管中,分別添加0.02 mL 10 ng/mL、0.2 mL 100 ng/mL混合標準使用液和0.2 mL 500 ng/mL混合標準使用液,照1.2.1方法操作,得到加標溶液,分別對每個添加水平進行平行測試6次,計算平均回收率及相對標準偏差(RSD)。各化合物的回收率為77.9%～114.5%,符合多殘留分析要求,見表3。

2.5.4 實際樣品的測定 采用本研究方法對廣西11個地市共82批次雞蛋進行藥物殘留篩查,結果檢出9批次雞蛋含有磺胺甲基異惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝唑、金剛烷胺和氟苯尼考,與國家標準或行業標準(GB/T 22338-2008 《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》、SN/T 4253-2015 《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜 質譜法》、GB/T 21316-2007 《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質譜/質譜法》、SN/T 1928-2007 《進出口動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》)方法測定結果進行比較,結果見表4,本方法與標準方法的相對標準偏差為1.4%～9.7%,表明本研究方法數據準確可靠。

表4 本方法與標準方法測定結果比較Table 4 Comparison of the results betweenthis method and the standard method

3 結論

本研究采用改進的多壁碳納米管-QuEChERS方法建立了LC-MS/MS同時測定雞蛋中氯霉素、氟蟲腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5類共44種藥物殘留量的高通量篩查方法,測定多類藥物殘留,簡單快速,節約檢驗成本與檢驗周期,凈化效果好,靈敏度、準確度和精密度高,彌補國家標準和行業標準分類檢測的不足,適應日常大批量的雞蛋中藥物殘留的監管,為獸藥殘留檢測標準修訂提供基礎數據。