QuEChERS-氣相色譜-三重四極桿質譜法同時測定枸杞中46種農藥殘留

李 莎,曾習文,李亦蔚,易守福,董 艷

(1.長沙縣食品安全檢測中心,湖南長沙 410100; 2.湖南省食品質量監督檢驗研究院,湖南長沙 410017)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科類灌木,是我國傳統的藥食同源植物。枸杞主要含有胡蘿卜素、核黃素、酸漿果紅素、抗壞血酸、煙酸、甜菜堿及微量元素等化學成分,具有補腎養肝、潤肺明目、降血糖、降血脂等多種功效[1-2],其豐富的營養價值和保健功效倍受人們的青睞。由于枸杞含糖量高,易發生木虱、實蠅、癭螨、蚜蟲等蟲害,且防治難度大[3-4]。目前大部分市售枸杞來源于人工栽培,規模化種植使得大面積病蟲害的發生較為頻繁和嚴重。為了提高產量,大量使用多種農藥進行防治,造成枸杞農藥殘留嚴重,影響枸杞質量安全[5-6]。近年來,隨著國際貿易競爭的不斷加劇以及各國對食品安全要求的提高,歐盟、美國、日本等國家都對枸杞產品制定了嚴格的農藥殘留限量,然而我國出口枸杞中農藥殘留超標被官方通報的情況時有發生。農藥殘留問題已經成為我國枸杞出口所遭遇的主要技術性貿易壁壘。因此,建立枸杞中快速、準確、高效的多農藥殘留檢測方法對于控制枸杞農藥殘留污染、促進枸杞產業健康發展至關重要。

目前對于枸杞中農藥殘留量的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)[7-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-12]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[13-15]及氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[16-17]。氣相色譜-質譜聯用法兼具氣相色譜高分離效能和質譜準確鑒定化合物結構的特點,可達到同時定性定量的檢測目的。但單級質譜靈敏度和選擇性不理想,易受基質成分干擾,GC-MS/MS相對于傳統的GC-MS而言,在農藥殘留檢測領域具有高效、穩定、基質干擾小等突出優點。目前,將GC-MS/MS檢測技術用于枸杞中農藥殘留檢測的研究報道較少,方翠芬等[18]采用乙酸乙酯提取濃縮枸杞樣品,建立了測定枸杞中23種農藥殘留量的GC-MS/MS方法。由于枸杞中含有大量色素及多糖類物質,基質復雜,在質譜分析中可能帶來嚴重的基體效應和干擾,在進行儀器分析前,需采取適當的前處理方法去除基質中的干擾物。現行的國家標準及文獻報道方法[14,19]多采用固相萃取法(SPE)進行凈化,SPE柱凈化效果雖好,但價格較昂貴,且操作繁瑣。QuEChERS方法具有操作簡便、快速、凈化效率高、消耗有機溶劑少、成本低等優點,被廣泛應用于復雜基質中多農藥殘留的檢測[20]。

本研究將GC-MS/MS檢測系統與QuEChERS前處理方法結合,用于枸杞中多種農藥殘留快速提取檢測。樣品經乙腈提取,提取液通過QuEChERS法凈化排除復雜基體的測定干擾,利用GC-MS/MS在MRM模式下直接測定,建立了同時測定枸杞中46種農藥殘留的方法。該方法高效、快速、靈敏、準確,能滿足枸杞中農藥殘留的檢測要求,可為枸杞的質量控制提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞樣品 購自超市和藥店;46種農藥標準品(46種農藥標準品名稱見表1,1000 μg/mL) 北京壇墨質檢科技有限公司;乙腈、正己烷、丙酮 色譜純,德國默克公司;無水硫酸鎂、氯化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;凈化管1號(含150 mg MgSO4填料) 自制;凈化管2號(含150 mg MgSO4,50 mg N-丙基乙二胺(N-propyl ethylenediamine,PSA)填料)、凈化管3號(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18填料)、凈化管4號(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18,7.5 mg石墨化碳黑(Graphitized carbon black,GCB)填料) 安捷倫科技有限公司。

Agilent 7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿質譜儀 美國Agilent公司;TD5K臺式離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司;XY-100高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金廠;MS3 digital旋渦混勻器 IKA儀器設備有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒托利多有限公司;HN132樣品濃縮儀 濟南海能儀器有限公司;SMART-NE超純水儀 上海康雷分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 提取:稱取經粉碎均勻枸杞試樣5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加10 mL超純水渦旋混勻,靜置30 min。精密加入10 mL乙腈,劇烈振蕩渦旋2 min,加入2 g NaCl后劇烈振蕩渦旋2 min,再以4000 r/min的轉速離心3 min,上清液待凈化。

凈化:準確移取上清液2 mL,置于預先裝有加入150 mg MgSO4,50 mg PSA的凈化管中,劇烈振蕩渦旋2 min,再以4000 r/min的轉速離心3 min,精密移取清液1 mL,氮吹干后用丙酮溶劑定容至0.5 mL,過0.22 μm有機濾膜,供GC-MS/MS分析檢測。

1.2.2 標準溶液配制及標準曲線繪制 混合標準中間液:分別吸取0.10 mL 1000 μg/mL各農藥標準液置于10 mL容量瓶中,用丙酮定容,得到10 μg/mL的混合標準中間溶液,于-18 ℃下避光、密封保存。

混合標準使用液:精確吸取一定量的混合標準中間溶液,逐級用丙酮釋成質量濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的混合標準使用液。

基質混合標準使用液:取6份1 mL按1.2.1制備的空白基質溶液氮氣吹干,分別加入1 mL上述相應質量濃度的混合標準使用液復溶,配制成系列基質混合標準使用液。以46種農藥的基質標準使用液的質量濃度為橫坐標,各物質的定量離子對峰面積為縱坐標,繪制基質匹配標準曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);載氣:高純氦氣(99.999%);碰撞氣:高純氮氣(99.999%);恒流模式流速:1.0 mL/min;進樣方式:不分流進樣,進樣量:1 μL;進樣口溫度:280 ℃;柱溫:初始溫度40 ℃保持1 min,以40 ℃/min升溫至120 ℃,再以5 ℃/min升溫至240 ℃,最后以12 ℃/min升溫至300 ℃,保持6 min。

1.2.4 質譜條件 電離方式:電子轟擊離子源(EI);電離能量:70 eV;離子源溫度:280 ℃;四級桿溫度:150 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;掃描模式:多重反應監測(MRM),46種農藥殘留的保留時間、定量離子對、定性離子對、碰撞能量條件見表1。

表1 46種農藥化合物的保留時間及質譜采集參數Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters of 46 pesticide compounds

1.3 數據處理

采用Agilent MassHunter軟件進行數據采集及處理。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

分別對46種農藥化合物進行全掃描,選擇2～3個特征且豐度高的離子作為母離子。再分別對每個母離子進行子離子掃描,設定碰撞電壓在5～35 eV之間,每隔5 eV進行1次碰撞優化碰撞能量,擇優選取強度和信噪比兼顧的離子對分別作為定量和定性離子對。本文選用Agilent HP-5MS柱,在分離過程中采用程序升溫可有效地改善峰形,通過分段離子掃描可有效提高儀器檢測靈敏度。經過優化,46種農藥殘留組分多反應監測模式條件及保留時間如表1所示。

氣相色譜-三重四極桿質譜法檢測100 ng/mL氧樂果等46種農藥化合物基質混合標準溶液,所得總離子流圖如圖1所示。

圖1 46種農藥混合基質標準溶液的總離子流圖Fig.1 TIC of 46 pesticide mixed matrix standard solutions 注:峰形上方的編號與表1中各組分編號代表的農藥名稱一一對應。

2.2 樣品前處理方法的考察

2.2.1 提取溶劑的選擇 以加入100 μg/kg農藥混標的枸杞樣品為研究對象,考察了丙酮、乙腈、正己烷三種不同溶劑對各農藥組分的提取效果。結果表明46種農藥組分在丙酮、乙腈、正己烷三種溶劑中的平均回收率分別為86.62%、89.75%和67.53%。正己烷極性相對較弱,不利于提取極性較大的農藥組分;使用丙酮提取液中色素等雜質較多,容易造成儀器污染并影響檢測結果;乙腈提取效果最好,農藥回收率高,由于乙腈適宜于萃取極性范圍較寬的多種農藥,且不易提取色素和脂肪等非極性成分[21],使凈化更簡便且提取效果最好,所以本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化劑的選擇 本實驗以2 mL離心后的100 μg/kg加標樣品提取液為研究對象,對MgSO4、PSA、GCB、C18的種類和用量進行優化。對比4種凈化管(填料配比詳見1.1)的凈化效果,結果表明,隨著填料種類的增加,凈化液越來越澄清(圖2),說明凈化效果越好,表明PSA、C18和GCB在枸杞前處理過程中都發揮了相應的除雜效果。同時,對4組填料下46種農藥的回收率進行比較,發現含150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA的凈化劑(2號凈化管)不僅可以將枸杞樣品中的雜質凈化,且對目標農藥的吸附少,各農藥組分的平均回收率最高,均在80%～100%范圍內。這是因為枸杞中主要含多糖類、胡蘿卜素、纖維素等營養成分,PSA可將其有效吸附;C18和GCB的加入雖對色素去除更徹底,但也對極性較弱和平面結構的農藥有較強的吸附作用,使目標組分的回收率降低[20,22]。因此,本方法優先采用2號凈化管(含150 mg MgSO4,50 mg填料)對枸杞提取樣液進行凈化處理。

圖2 4組混合填料的凈化效果Fig.2 Purification effects of thefour groups of mixed adsorbents

2.3 基質效應

基質效應是樣品中其他組分對待測物離子化的影響,導致在進行儀器分析時待測組分的響應出現增強或抑制。基質效應用ME表示,ME(%)=(B-A)/A×100(A和B分別為溶劑和基質標準曲線的線性方程斜率),︱ME︱<10%提示基質效應較小,可用溶劑標準曲線進行定量;10%<|ME|<50%提示基質效應較大,需要用基質標準曲線進行定量以消除基質效應對結果的影響;︱ME︱>50%提示基質效應很強,嚴重影響定量,需要重新優化樣品前處理方法[23]。

本研究分別采用空白基質提取液和丙酮溶劑配制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的標準工作液,在相同條件下進行檢測,最后分別建立基質標準曲線和溶劑標準曲線,通過上述公式計算ME值,判斷基質效應。結果發現各農藥組分的ME值均在10%～50%之間(見表2),表明存在明顯的基質增強效應,在本研究中使用基質匹配外標法對46種農藥的殘留量進行準確定量。

2.4 線性關系、相關系數和檢出限

將46種農藥配制成6個不同質量濃度的混合基質標準溶液,分別為0.01、0 02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL。如表2所示,各組分在相應濃度范圍內呈良好的線性關系,線性相關系數r在0.9941～0.9999之間。以信噪比S/N=3和S/N=10所對應的濃度,分別計算各農藥組分的檢出限和定量限,方法檢出限為0.02～3.90 μg/kg,定量限為0.05～12.99 μg/kg(見表2)。

2.5 方法的回收率和精密度

在空白枸杞樣品中添加濃度分別為10、50、100 μg/kg的46種農藥標液,渦旋2 min,靜置2 h,按上述所選擇的最優條件進行測定,每個添加水平做6次平行實驗,計算平均加標回收率和相對標準偏差。測得平均回收率為71.5%～99.8%,相對標準偏差(RSD)為0.7%～8.9%,實驗結果見表2。枸杞樣品檢測結果的精密度和準確度均達到GB/T 27404-2008中農藥殘留檢測的要求。

表2 枸杞中46種農藥的線性方程、相關系數、基質效應、檢出限、定量限、回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients,matrixeffects(MEs),limit of detection(LOD),limit ofquantification(LOQ),recoveries and standard deviations of 46 pesticide residues in Lycium barbarum(n=6)

2.6 實際樣品測定

采用本方法對10批次枸杞樣品中46種農藥殘留量進行測定,結果4批樣品檢出農藥殘留,其余樣品均未檢出。其中有2批樣品檢出克百威,且含量超出GB 2763-2016規定的限量值20 μg/kg,含量分別為66.7和40.2 μg/kg;另有2批樣品檢出毒死蜱分別為39.2、26.3 μg/kg,1批樣品檢出腐霉利19.4 μg/kg,2批樣品檢出氯氟氰菊酯分別為135、130 μg/kg,1批樣品檢出氟氯氰菊酯262 μg/kg,含量均未超過國家限量值,測定結果見表3,部分陽性樣品的色譜圖見圖3。

表3 4批枸杞農藥殘留測定結果(μg/kg)Table 3 Determination results of pesticide residuesin the 4 batches of Lycium barbarum(μg/kg)

圖3 枸杞樣品-3的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatogram of Lycium barbarum-3 sample

3 結論

本文首次將QuEChERS前處理方法結合GC-MS/MS檢測技術用于枸杞中多種農藥殘留的快速分析檢測。用此方法檢測枸杞中46種農藥殘留時,在0.01～0.20 μg/mL范圍內線性關系良好,檢出限和定量限分別為0.02～3.90和0.05～12.99 μg/kg;3個不同濃度添加水平的平均回收率為71.5%～99.8%,相對標準偏差為0.7%～8.9%,均能滿足檢測要求。10批次枸杞樣品中4批次檢出農藥殘留,部分枸杞中存在農藥殘留超標的情況,提示枸杞生產過程中存在不規范使用農藥的情形,因此,對枸杞農藥殘留進行有效監控非常必要。該方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高,能夠滿足枸杞中多種農藥殘留的定性及定量檢測,可為枸杞的質量控制提供技術支撐。