基于UPLC-MS/MS同時分析福建烏龍茶和白茶中的兒茶素類物質

黃 彪,劉文靜,方 靈,韋 航,吳建鴻,傅建煒,*

(1.福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,福建福州 350003; 2.福建省農產品質量安全重點實驗室,福建福州 350003)

我國茶葉品種資源多,種植范圍廣,制作工藝歷史悠久。一般根據(jù)外形、色澤及制作方法的不同將茶葉分為綠茶、紅茶、黃茶、青茶(烏龍茶)、黑茶和白茶六大茶類[1]。不同茶葉生理功效和活性成分的研究一直是近些年來的熱點。研究表明茶葉品質及其活性成分不僅與茶樹品種相關[2-4],還與生長環(huán)境[5-6]、采摘時期[3]、加工工藝[7-9]等諸多因素相關。福建省茶樹品種資源豐富,茶葉生產工藝獨特,茶葉品質優(yōu)良,較為出名的有烏龍茶 “鐵觀音”、“武夷肉桂”、“大紅袍”、“武夷水仙”,白茶“福鼎白茶”、“政和白茶”等等。福建出產的茶葉香氣醇厚,富含多種活性成分,尤其是烏龍茶與白茶等具有良好保健功效,經中醫(yī)藥理證明有消暑解毒,消炎治病的功效[10-11]。

茶葉因含茶多酚、咖啡堿、氨基酸、茶多糖、維生素等營養(yǎng)功能成分[12-13],其良好的抗衰老、抗癌變、殺菌和降低血糖等功效一直以來受到研究者的重視[14-16]。茶葉中的茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、酚酸類、花色素類等物質,其含量占茶葉干重的20%左右;而具有抗氧化作用的兒茶素類物質占茶多酚總量的70%左右,主要包括兒茶素((+)-catechin,C)、表兒茶素((-)-epicatechin,EC)、沒食子兒茶素((-)-gallocatechin,GC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、兒茶素沒食子酸酯((-)-catechin gallate,CG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG),沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-gallocatechin gallate,GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)等物質。目前對兒茶素類物質的測定方法研究多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[17-19]。從靈敏度、準確性上看,HPLC法是目前較為有效的方法,但是HPLC方法往往存在前處理步驟繁瑣、檢測用時長等問題;而茶葉中的多酚物質多為易氧化的活性物質,檢測時間長有可能造成檢測結果不準確。而UPLC-MS/MS聯(lián)用技術能將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性和高靈敏度有效結合起來,檢測過程迅速,在農產品質量安全和食品檢測的領域的應用日益廣泛,但是運用LC-MS/MS技術對茶葉中活性物質多組分的分析仍不多見[20-22],而目前有關LC-MS/MS方法分析福建茶葉中活性物質含量的報道則更為少見。

本研究以福建烏龍產和白茶為研究對象,建立了同時快速分析茶葉中8種兒茶素物質的UPLC-MS-MS方法,分析比較了幾種福建烏龍茶和白茶中兒茶素類活性物質含量,以期為福建茶葉資源的利用和產品開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶鐵觀音(2018) 福建泉州市安溪縣;肉桂(2018)福建武夷山市。白茶:白牡丹(2018)福建福鼎市;壽眉(2018)福建福鼎市;兒茶素(C)、表兒茶素表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)等 純度>97%,南京道斯夫生物技術股份限公司;甲醇、乙腈、甲醇 色譜純,Fisher公司;乙酸銨、甲酸 LC-MS級,Waters公司;其他試劑 均為國產分析純。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四級桿質譜 美國Waters公司;XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學儀器廠;Millipore Direct-Q5超純水儀 美國Millipore Qirect-Q5;SYG-2水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 UPLC-MS/MS方法樣品前處理及標準溶液配制 樣品前處理:稱取0.2 g磨碎過篩后的茶樣于10 mL棕色玻璃管中,加入在70 ℃預熱過的70%甲醇溶液5 mL,混勻后置于70 ℃水浴中振蕩提取10 min(每隔5 min攪拌一次),提取后冷卻至室溫,在3500 r/min轉速下離心10 min,將上清液轉移至10 mL容量瓶。殘渣再用5 mL 70%甲醇溶液提取一次,重復以上操作。合并提取液定容至10 mL,搖勻,0.45 μm濾膜過濾,濾液稀釋1000倍,待上機分析用。

標準溶液配制:精確稱取標準物質各10.0 mg,分別用甲醇溶解后定容到10 mL,即得濃度為1000 μg/mL的不同標準品物質單標母液,備用。用于制作標準工作曲線的不同濃度的混標溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 HPLC方法樣品前處理及標準溶液配制 參照GB/T 8313-2018茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法。

1.2.3 UPLC-MS/MS方法色譜條件 色譜柱:Waters T3 C18柱(Φ1.8 μm,2.1 mm×50 mm);柱溫:30.0 ℃;流速:0.2 mL/min;流動相A為0.1%(V/V)甲酸水溶液,流動相B為甲醇;洗脫梯度:0～3 min,90%～70% A;3～5 min,70%～30%A;5～8 min,30%～90% A;進樣量:4 μL。

1.2.4 UPLC-MS/MS方法的質譜條件 參考文獻質譜方法檢測兒茶素的條件[23]。掃描方式:電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:2.5 kV;脫溶劑氣:N2,流速800 L/h,脫溶劑溫度:500 ℃;錐孔氣流:N2,流速50 L/h;離子源溫度:150 ℃;霧化氣壓力:0.28 MPa;碰撞氣:氬氣。以100 μg/L的兒茶素類物質的單標溶液進行質譜參數(shù)優(yōu)化,確定特征母離子和子離子,優(yōu)化后相關質譜參數(shù)見表1。

表1 8中兒茶素類物質檢測的質譜參數(shù)條件Table 1 LC-MS/MS parameters for 8 catechin compounds

1.2.5 HPLC方法的色譜條件液相色譜條件 參照國標方法GB/T 8313-2018茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法色譜條件[24],實驗在Waters e-2695高效液相色譜儀上完成。色譜柱:Waters CORTECS C18柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱溫:35.0 ℃;檢測器:二極管陣列檢測器;檢測波長:278 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:5 μL;流動相A和流動相B為按GB/T 8313-2018方法配制成的乙腈-水溶液。洗脫梯度:0～10 min,保持100% A;10～15 min,100%～68% A;15～25 min,保持68% A;25～30 min,68%～100% A。進樣量:10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS/MS方法數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在Waters三重四級桿液相色譜串聯(lián)質譜儀MassLynx軟件上進行處理,實驗重復3次,外標法定量。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

國標方法[24]利用液相色譜法檢測茶葉中兒茶素類物質,在將茶葉樣品用70%甲醇溶液提取,得到提取液母液后,檢測分析前加入穩(wěn)定溶液(由10 mg/mL EDTA溶液25 mL,10 mg/mL抗壞血酸溶液25 mL,乙腈50 mL加入到500 mL容量瓶中定容后得到)。由于茶葉中多酚物質往往容易氧化,而茶葉中的多酚物質主要為兒茶素類物質,較容易氧化且由于種類較多,利用HPLC分離、檢測往往耗時較長,為保持茶葉中兒茶素類物質的穩(wěn)定性,保證結果的準確,往往需要加入穩(wěn)定液。而UPLC和UPLC-MS/MS由于分離速度快,檢測迅速,相關文獻報道在利用70%甲醇溶液提取樣品后進行UPLC和UPLC-MS/MS分析,一般不加入穩(wěn)定溶液而直接進行上機檢測[17]。另外利用超高效液相色譜—串聯(lián)質譜儀進行檢測分析,提取液通過色譜柱分離,經霧化器霧化后,經質譜檢測器檢測,應避免用無機酸及鹽進入質譜儀以免對儀器造成損害。因此,實驗建立UPLC-MS/MS方法檢測茶葉中兒茶素類物質,在前處理過程中得到提取液母液,參考文獻[17]提取方法,在母液中不添加穩(wěn)定液。由于UPLC-MS/MS靈敏度較高,在得到母液后,稀釋1000倍,經0.45 μm濾膜過濾后直接上機測試。

2.2 方法評價

2.2.1 標準工作曲線及檢出限 將兒茶素類化合物標準品溶液按照1.2中小節(jié)中的條件進樣,目標化合物的多反應監(jiān)測色譜圖如圖1所示。在優(yōu)化條件下,考察了8種目標化合物的線性范圍,相關系數(shù)及檢出限。在各化合物相應的濃度范圍內,目標化合物的標準曲線標準溶液濃度(x,μg/L)與對應的峰面積(y)呈良好線性關系,相關系數(shù)(r)為0.9966～0.9994。依據(jù)特征離子色譜峰色譜信號的3倍信噪比(S/N(3)確定方法的檢出限,方法的檢出下限為0.2～1.1 μg/L(表2)。

表2 8種目標化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation coefficient and detection limit of 8 target compounds

圖1 8種兒茶素類化合物多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of 8 catechins

2.2.2 加標回收率 根據(jù)各目標物的響應信號情況及在茶葉中的含量情況進行了相應的加標實驗(n=6),加標回收率為85.9%～109.1%,相對標準偏差(RSD)在0.9%～6.7%之間(表3),方法符合的檢測要求。

表3 茶葉中8種兒茶素類物質測定的加標回收實驗(n=6)Table 3 Recovery rates of 8 catechins compounds

2.2.3 精密度實驗 選取2、5、10、50、100 μg/L 5個濃度的各化合物標準品溶液驗證精密度,按照優(yōu)化的實驗條件進行測測試,每個濃度進行6次平行測試,結果表明:8種兒茶素類化合物標準品溶液含量的RSD均在0.032%～0.99%之間,說明該試驗方法具有良好的精密度,符合分析測定的要求。

2.2.4 重復性實驗 選取同一樣品6份,按照建立的方法進行前處理得到樣品提取液,同一批進樣。結果表明樣品檢測出的7種兒茶素類物質含量的RSD均在0.28%～1.01%之間,表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 將所得的樣品提取溶液,測定24 h內各兒茶素組分的含量變化。根據(jù)標準曲線得出樣品溶液各化合的含量,計算各組分含量的相對標準偏差RSD值來考察各組分在樣品溶液的穩(wěn)定性,結果表明兒茶素類物質的含量隨時間呈下一定的下降趨勢,但其含量的RSD值在0.061%～1.49%之間,雖然有下降但是下降幅度較小,樣品溶液具有一定的穩(wěn)定性,主要是因為兒茶素類物質長時間存放可能氧化的原因,說明在對樣品進行提取后,檢測迅速有利于結果的準確。

2.3 HPLC與UPLC-MS/MS檢測茶葉中兒茶素類物質含量的比較

相對于HPLC,UPLC-MS/MS檢測更為迅速、靈敏、準確。HPLC多通過對目標化合物的紫外吸收形成的色譜峰的識別而實現(xiàn)對物質的定性、定量,有時易產生假陽性;UPLC-MS/MS通過對目標化合物母離子、碎片子離子的識別實現(xiàn)對物質的定性、定量,但是在質譜檢測中有時由于抑制效應影響碎片子離子的形成而對檢測結果造成一定的影響。在實驗中,選取樣品分別利用UPLC-MS/MS與HPLC法對茶葉中兒茶素類物質含量的分析進行了比較,如表4所示,兩種方法檢測兒茶素類物質含量較為接近,兒茶素類物質的含量相對標準偏差(RSD)均<10%,說明建立的方法準確度高。

表4 HPLC與UPLC-MS/MS檢測茶葉中兒茶素類物質含量比較(mg/g)Table 4 Comparison of detection results of HPLC and UPLC-MS/MS methods(mg/g)

2.4 茶葉樣品的檢測

選取采集的烏龍茶樣品3份(其中鐵觀音2份,肉桂1份),白茶樣品5份(其中白牡丹2份,壽眉3份)按照建立的方法,對茶葉中的兒茶素類化合物含量進行檢測分析。每個樣品重復測定3次,不同茶類樣品中兒茶素類物質含量的檢測結果見表5所示。

表5 不同工藝的茶類其活性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of ten bioactive compounds in different tea samples(mg/g)

從實驗結果來看,相對于其它兒茶素類物質,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在茶葉中的含量最高,約占茶葉中兒茶素總量的60%。分析所收集的幾種福建茶葉樣品,烏龍茶中兒茶素總量的含量范圍為43.59～45.21 mg/g,白茶兒茶素總量的含量范圍為50.52～70.71 mg/g。白茶中EGCG及兒茶素總量較烏龍茶中高,這主要因為白茶加工工藝相對簡單,其生產加工主要是茶鮮葉經過長時間的萎凋,然后烘干。在長時間的萎凋過程中,兒茶素類物質在多酚氧化酶、過氧化物酶等作用下發(fā)生緩慢而輕度的氧化反應,茶葉中兒茶素的主要成分EGCG含量有一定程度的減少,兒茶素總量也會有所降低。而烏龍茶作為一種半發(fā)酵茶,其制作工藝相對復雜,曬青、涼青、做青等工序歷時較長,發(fā)生以多酚類酶促氧化作用和水解作用為主導的一系列生化反應,EGCG含量下降較多,兒茶素總量的變化也較大。

3 結論

建立UPLC-MS/MS方法對茶葉中的兒茶素類物質進行檢測,方法簡便、快速,有效縮短分析時間。運用該方法對福建省幾種茶葉中的兒茶素類物質進行了分析,所收集的樣品中EGCG在茶葉中的含量均為最高。由于品種與加工工藝的不同,相對來說,白茶樣品中EGCG的含量與兒茶素的總量較烏龍茶高。本研究建立的方法可為茶葉中多種活性物質的分析提供參考,本研究的實驗結果可為茶葉品質與營養(yǎng)功能的進一步研究提供科學依據(jù),對于不同茶葉資源的開發(fā)研究具有一定的參考意義。