組織研磨-QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源食品中磺胺類藥物殘留以及基質效應的研究

張虹艷,邱國玉,吳福祥,許曉輝,李晨曦,潘秀麗,王小喬

(蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅蘭州 730050)

隨著人民生活水平的改善,藥物殘留日益受到關注[1]。磺胺類藥物(sulfonamides,SAs)是一類含有對氨基苯磺酰胺結構的廣譜抗菌藥物,廣泛的應用于畜牧和水產養殖。由于養殖戶在預防和治療動物疾病過程中的不規范使用,導致動物源食品中出現抗菌類藥物殘留[2]。磺胺類藥物殘留通過食物鏈進入人體會引起過敏反應、腸道菌群失調等副作用[3]。我國以及歐盟對動物源性食品中磺胺類藥物殘留限量有嚴格規定,我國農業部第235號公告要求,動物源性食品以及組織中磺胺類總量最大殘留限量為100 μg/kg。

目前,磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-5]、液相色譜-串聯質譜法[6-7]、毛細管電泳[8],免疫分析法[9]。高效液相色譜法通用性強;免疫分析法專屬性高、操作簡易;毛細管電泳分離效能高、試劑、耗材消耗少,但是上述三種方法均存在靈敏度低的問題,不適用于痕量物質的檢測。液相色譜-串聯質譜法通過保留時間、特征離子對以及離子對豐度比進行定性定量分析,方法專屬性強,靈敏度高,越來越成熟的應用于藥物殘留檢測。藥物殘留檢測中應用較多的前處理技術有固相萃取(SPE)[10-11]、加速溶劑萃取(ASE)[12]、基質分散固相萃取(MSPD)[13-14]、QuEChERS[15-16]、微波輔助萃取(MAE)[17]、磁性固相萃取[18-19]。

上述前處理方法過程復雜,大多數需要經過提取、凈化、濃縮等步驟,既消耗了大量的時間和耗材,同時降低了方法的檢測靈敏度,磁性固相萃取技術多以石墨烯為材料,成本較高。QuEChERS法具有高通量、低成本、節省試劑和耗材的優勢,被廣泛應用于果蔬、植物、谷物、肉類的檢測,并納入GB 23200.113-2018(植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定)。由于動物源性食品基質復雜,前期的研究大多未考慮不同樣品基質對定量結果的影響。基質效應主要指試樣中的非待測組分影響待測物濃度或質量測定的準確度,引起待測物響應值增加或減少的現象[20]。不同的前處理方法、不同的樣品來源、不同的色譜分析條件、不同的離子源都會產生基質效應。樣品中的共流物與目標成分產生離子競爭,從而導致目標物的離子化效率升高或者降低,引起基質效應增強或者基質效應抑制[21],是導致液相色譜-串聯質譜法定量分析結果不準確的直接原因。

針對上述情況,本實驗以豬肉、牛奶、雞蛋為研究對象,采用組織研磨儀-QuEChERS-三重四極桿液質聯用儀,對動物源性食品中磺胺類獸藥殘留進行研究。組織研磨儀采用上下垂直高速振蕩模式,可以促進細胞快速破碎、細胞裂解、組織勻漿,使得樣品研磨更加均勻、充分,樣品重復性好,樣品之間沒有交叉污染,同時節省了時間和人力成本的消耗,是一種高通量高速率高效的樣品前處理技術。研究不同條件下,組織研磨儀對磺胺類藥物提取效果的影響,并探索豬肉、雞蛋、牛奶三種動物源性食品的基質效應,為優化獸藥殘留檢測方法、提高獸藥殘留檢測技術提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉(后腿)、牛奶(未脫脂)、雞蛋 均為蘭州市超市采購;磺胺間二甲氧嘧(SDM,純度≥99.4%)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX,純度≥99.1%)、磺胺喹沙啉(SQX,純度≥98.9%)、甲氧芐啶(TMP,純度≥99.8%)、磺胺氯噠嗪(SCP,純度≥99.1%)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM,97.0%)、磺胺二甲嘧啶(SM2,純度≥100.0%)、磺胺甲基嘧啶(SMR,純度≥99.7%)、磺胺甲惡唑(SMZ,純度≥99.5%)、磺胺嘧啶(SDZ,純度≥99.7%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈 色譜純,默克公司;QuEChERS萃取鹽包(5982-0032)、EMR-Lipids凈化管(5982-1010) 安捷倫;EDTA緩沖液(檸檬酸8.4 g,磷酸氫二鈉7.1 g,乙二胺四乙酸二鈉19.5 g,溶于650 mL水中)。

1290-6460三重四極桿液質聯用儀 美國安捷倫;GENO2010組織研磨儀 美國SPEX;5810R冷凍離心機 德國艾本德;VORTEX KB-3渦旋振蕩器 中國海門其林貝爾;MS105DU電子天平 美國梅特勒。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 標準品儲備液:準確稱取10 種磺胺類藥物標準品各10.00 mg,分別用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中,得到1 mg/mL磺胺類藥物標準品的儲備液,于4 ℃冰箱中保存。

混合標準溶液:分別精密移取各標準品儲備液0.1 mL至100 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容,配成濃度各為1.0 μg/mL的混合標準溶液,于4 ℃冰箱中保存。

基質標準溶液:稱取與試樣基質相應的陰性樣品,加入混合標準溶液適量,與樣品同時進行提取和凈化。

1.2.2 樣品前處理 將豬肉和雞蛋進行勻漿處理,牛奶直接取樣。準確稱取2.0 g(精確至0.01 g)以上樣品置于50 mL離心管中,加入3 mL EDTA緩沖液,組織研磨儀以1000 r/min的轉速提取2 min,準確加入5 mL乙腈,渦旋1 min,加入Bond QuEChERS萃取鹽包,渦旋1 min,靜置10 min,在4 ℃以8000 r/min低溫離心5 min,水和乙腈分層,收集上層液作為提取液。凈化管中,加入水2.5 mL,渦旋3 s,準確加入上述乙腈提取液2.5 mL,渦旋1 min,在4 ℃以8000 r/min低溫離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜,于高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 分析條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:C18(2.1×100 mm,2 μm);柱溫:35 ℃;進樣量:5 μL;流速:0.3 mL/min;流動相:A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min,95% A;1.0～2.5 min,95%～75% A;2.5～5.0 min,75% A～40% A;5.0～6.0 min,40% A;6.0～6.1 min,40% A～5% A;6.1～8.0 min,5% A;8.1～10.0 min,95% A。

1.2.3.2 質譜條件 電噴霧離子(ESI)源;多反應監測(MRM)模式檢測;霧化氣溫度:300 ℃;霧化器流速:11 L/min,噴霧電壓:15 psi。其余質譜參數見表1。

表1 10種磺胺類物質的質譜參數Table 1 Mass parameters of the ten sulfonamides

1.3 數據處理

采用安捷倫液質自帶數據處理軟件MassHunter(B.06)進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 流動相優化

分別比較了水-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈、0.2%甲酸溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈流動相體系梯度洗脫對10種磺胺類藥物響應值和分離度的影響,結果如圖1,使用水-乙腈梯度洗脫,10種磺胺類藥物的響應值和分離度均不佳;使用0.1%甲酸溶液-乙腈、0.2%甲酸溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈梯度洗脫均能有效分離8種磺胺類藥物,其中磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺甲惡唑分子結構相近未能基線分離,磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺喹沙啉分子結構相近未能基線分離。使用0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫和使用10 mmol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸-乙腈梯度洗脫10種磺胺類藥物分離度和響應強度沒有明顯差異,0.2%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫響應強度最弱。因為磺胺類藥物為弱堿性,在流動相中加入少量的甲酸,可以促進化合物帶正電荷,但是酸濃度過高,同樣也會抑制其電離。使用0.1%甲酸溶液-乙腈進行梯度洗脫,10種磺胺類藥物的響應值增強,峰形和分離度得到改善,因此選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相進行梯度洗脫溶液。

圖1 10種磺胺類藥物總離子流圖Fig.1 TIC of 10 sulfonamides standard solution

2.2 組織研磨儀條件優化

傳統的渦旋振蕩提取方式,動能低,樣品均勻性無法得到保證,導致實驗結果重現性不好。為了使得樣品研磨更加均勻、充分,樣品重復性好,保證樣品的重現性、有效性、可比性,組織研磨儀可設置研磨時間、研磨速率,保證每次研磨條件的一致性。分別設置不同研磨速率以及研磨時間,對比10種磺胺類藥物的回收率,確定最優研磨速率以及研磨時間。以豬肉為實驗對象,添加混合標準溶液100 μL(見1.2.1),10種磺胺類藥物的添加量為50 μg/kg。

設定研磨速率為1000 r/min,研磨時間分別為0.5、1、1.5、2、3 min,其余步驟按1.2.2進行樣品前處理,每個樣品平行測定3次,外標法定量。結果見圖2,隨著研磨從0.5 min逐漸升至3 min,10種磺胺類藥物的平均回收率呈現逐漸增大再回落的趨勢,研磨時間為2 min時,10種磺胺類藥物的平均回收率最高,研磨時間為3 min時,10種磺胺類藥物的平均回收率略有降低。因為動物組織隨著研磨時間增長,細胞破碎越充分,細胞內蛋白質等物質大量釋放,不利于磺胺類藥物的提取。

圖2 不同研磨時間對10種磺胺類藥物回收率的影響Fig.2 Effects of different grinder timeon the recoveries of ten sulfonamides

設定研磨時間為2 min,研磨速率分別為500、800、1000、1200、1400、1600 r/min(最大速率1750 r/min),其余步驟按1.2.2進行樣品前處理,每個樣品平行測定3次,外標法定量。豬肉在不同研磨速率下均可研磨呈肉糜狀,豬肉提取液隨著研磨速率升高,組織破碎越細膩均勻,顏色越淺,結果見圖3。研磨速率從500 r/min提高至1600 r/min時,10種磺胺類藥物回收率呈現整體緩慢增大之后保持平穩的趨勢。研磨速率提高至1000 r/min時,10種磺胺類藥物的平均回收率最高,研磨速率從1000 r/min提高至1600 r/min,回收率維持在穩定水平,說明當研磨速率提升至1000 r/min時,豬肉組織已研磨均勻,豬肉組織達到平衡狀態,因此選擇1000 r/min作為最適宜研磨速,如圖3所示。

圖3 不同研磨速率對10種磺胺類藥物回收率的影響Fig.3 Effects of different grinder rateson the recoveries of ten sulfonamides

2.3 基質效應評價

本試驗采用空白基質匹配標準校正法進行校正,使標準品和樣品在質譜電噴霧接口處具有一致的離子化條件,可以有效的消除基質效應,確保定量結果的準確性相同濃度的基質標準溶液和溶劑標準溶液分別進樣3針,化合物的基質效應(ME)=基質標準平均響應值/溶劑標準平均響應值[22]。若ME>1.0,則表示基質對分析物的響應產生增強效應;ME<1.0則表示基質對分析物的響應產生抑制;ME=1.0,則表示不存在基質效應[23-25]。ME偏離1.0的程度越大基質效應越強,ME越接近1.0,基質效應越小。

2.3.1 不同磺胺類藥物濃度基質效應評價 本試驗以豬肉為研究對象,采用組織研磨-QuEChERS前處理方法,考察了不同濃度的磺胺類藥物的基質效應,制備基質標準曲線與對應質量濃度的溶劑標準曲線,對比濃度分別為2、5、10、20、50、100 μg/L六個濃度水平溶劑標準曲線基質效應的差異(對應的基質標準曲線濃度為10、25、50、100、250、500 μg/kg)。結果如圖4所示,磺胺氯噠嗪(SCP)在不同濃度下均表現為基質增強,磺胺間甲氧嘧啶(SMM)在不同濃度下均表現為基質抑制,其他8種磺胺類藥物在同一濃度水平下基質效應差異不明顯。隨著目標化合物濃度增大,多數化合物基質效應隨之減小,整體呈現出低濃度基質增強,高濃度基質抑制的趨勢。可能是因為豬肉含有大量蛋白質和脂肪等成分,與磺胺類藥物共流出,導致顯著的基質效應。藥物濃度小于10 μg/L時(對于的基質標準曲線濃度為50 μg/kg),基質效應顯著增強。隨著藥物濃度增大,基質相對目標化合物的濃度降低,爭奪離子能力降低,基質效應降低并趨于穩定,但部分藥物由基質增強變為基質抑制,初步推測可能和藥物性質有關,目前暫無報道,有待進一步研究。

圖4 不同濃度磺胺類藥物對基質效應的影響Fig.4 Effects of different concentrationonthe matrix effect of ten sulfonamides

2.3.2 不同樣品基質基質效應評價 本試驗基于不同樣品基質對分析結果的影響進行研究,以豬肉、牛奶、雞蛋三種動物源食品作為研究對象,添加混合標準溶液,10種磺胺類藥物的添加量分別為10、25、50、100、250、500 μg/kg,采用組織研磨-QuEChERS前處理方法,選取其中高中低3個濃度點(10、50、250 μg/kg),以確定其基質效應。如表2所示,待測物濃度較低時(低于50 μg/kg),基質效應顯著增強,且豬肉的基質增強效應高于牛奶和雞蛋,牛奶和雞蛋的基質效應相當。待測物濃度較高時(高于50 μg/kg),基質效應減弱,且豬肉、牛奶和雞蛋的基質效應相當。

表2 動物源食品中磺胺類藥物在UPLC-MS/MS檢測下的基質效應Table 2 Matrix effects for UPLC-MS/MS analysis of sulfonamides in animal-originated goods

豬肉中蛋白質和脂肪含量高于牛奶和雞蛋,碳水化合物含量低于牛奶和雞蛋,推測親脂性成分的存在可能是造成磺胺類藥物測定基質效應的重要原因。在同一添加濃度下10種磺胺類藥物中磺胺間甲氧嘧啶在不同樣品基質中差異明顯,不同基質間的差異使用(最大值-最小值)/平均值進行計算,其他9種磺胺類藥物在不同基質間的差異在20%以內。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍及檢出限 稱取豬肉陰性樣品,加入混合標準溶液適量,按1.2.2進行前處理,結果表明,10種磺胺類藥物在質量濃度范圍內均呈現良好的線性關系,R2均大于0.99,以3倍信噪比計算檢出限(LOD),10倍信噪比計算定量限(LOQ),結果見表3。方法檢出限以及定量限均低于已有文獻的報道[2,7,9]。

表3 10種磺胺類藥物的線性回歸方程和相關系數Table 3 Regression equation,correlation coefficient of 10 sulfonamides

2.4.2 方法回收率以及精密度 稱取豬肉陰性樣品,加入混合標準溶液適量,按1.2.2進行前處理,進行回收率和精密度實驗。10種磺胺類藥物的添加量分別為10、50、250 μg/kg,每個濃度水平作6個加標實驗,使用基質標匹配,考察其回收率以及精密度。結果表明使用基質匹配標準曲線,能夠有效的降低基質效應,獲得了良好的回收率和精密度,平均回收率在89.4%～111.0%之間,精密度在0.8%～4.9%之間,結果見表4。

表4 豬肉中10種磺胺類藥物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of 10 sulfonamides in pork(n=6)

2.5 實際樣品分析

利用該方法對蘭州市場銷售的500批次畜禽肉、牛奶和雞蛋進行檢驗,共有11批豬肉樣品檢出磺胺二甲嘧啶,選取其中1批豬肉,使用國標方法和本方法同時檢測,結果見表5,GB/T 21316-2007檢出限較高,結果為未檢出,農業部1025號公告-23-2008和本試驗方法檢測值的相對誤差為7.5%,該方法簡化了國標的前處理方法,操作簡單,靈敏度高,適用于動物源食品中磺胺類藥物的檢測。

表5 本實驗方法與其他測定肉類食品中磺胺類藥物方法的比較Table 5 Comparison of this method with other methods for the determination of SAs in meat product

3 結論

本實驗采用組織研磨-QuEChERS技術結合三重四極桿液質聯用儀,對動物源性食品中的磺胺類藥物進行分析檢測,方法可行。使用組織研磨儀能夠有效提取目標化合物,具有高通量、重復性好、方法回收率高、節約體力等特點,通過基質效應分析,適用于動物源性食品中磺胺的檢測。動物源性食品基質復雜,組織研磨-QuEChERS技術在檢測低濃度樣品時(低于50 μg/kg)有明顯的基質效益,今后的研究應深入探尋化合物組成與基質效應的關系,部分藥物濃度由低到高,其基質效益由基質增強變為基質抑制,初步推測可能和藥物性質有關,有待進一步研究。