三七凍干粉及其活性組分對小鼠1型輔助性T細胞分化和活性的影響

張明菲,范瑤婕,楊 培,王 祥,周玲玲

(南京中醫藥大學藥學院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇南京 210023)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)在臨床實踐中是一種寶貴的中草藥[1],微苦、藥性溫和,具有止血、消除疲勞、消腫止痛等功效。隨著醫學模式從治療醫學向預防醫學的轉變,三七越來越多的生物活性功效被人們所知曉,因此頻繁地被應用于保健食品領域[2]。1994年美國膳食補充劑健康與教育法將三七列為膳食補充劑[3]。在中國,三七被列入到衛生部“可用于保健食品的物品名單”中,從2002年起開始應用于保健食品[4]。

目前,國家食品藥品監督管理局公布的保健食品中含有三七的產品有60多種,涉及多種保健功能,現代研究表明,三七在血液系統,心血管系統,神經系統,免疫系統等多方面具有生物活性[5-7]。現代藥理研究表明,自身免疫病、糖尿病等多種疾病均與免疫因素相關。CD4+輔助性T細胞(T helper,Th)是機體適應性免疫細胞,其可分化成Th1、Th2、Treg、Th17等不同的亞群,調控細胞和體液免疫應答過程[8]。其中Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18和其他細胞因子[8-9],可以有效地刺激細胞免疫反應和遲發型變態反應(DTH),與多種原因所致的炎癥反應密切相關,被稱為炎癥性T細胞。有研究發現,三七的主要活性組分三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)可以抑制類風濕性關節炎患者Th1細胞分泌細胞因子IFN-γ[10-12],因此三七對Th1細胞分化和活性的影響值得進一步研究。

本研究體外培養小鼠CD4+T細胞,將三七制備成三七凍干粉(Sanqi,SQ)用于細胞給藥,同時采用三七中主要活性組分PNS,觀察兩者對Th1分泌的IFN-γ表達水平及Th1特征性因子T-bet表達的影響,明確其對Th1細胞分化和活性的影響。為進一步明確三七調節免疫的作用機制和物質基礎提供依據,指導其作為藥品和保健食品的科學應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠 C57BL/6雄性小鼠15只,SPF級,6～8周齡,來自南京江寧青龍山動物繁殖場,動物合格證:SYXK(蘇)2017-0001;三七生藥 安徽亳州中藥飲片廠,經鑒定都符合2015版《中國藥典》一部中的相關規定;三七總皂苷(PNS) 南京景竹生物科技有限公司(貨號:JZ15101407,純度85%);刀豆蛋白A(ConA) Sigma公司;紅細胞裂解液 碧云天(批號20190215);Trizol 美國Life Technologies公司(批號79403);CD4+T細胞分選磁珠 美國BD公司(批號8129931);IFN-γELISA試劑盒 聯科生物(批號A280H90242)。

超微量紫外-可見光分光光度計 Thermo ScientificTMNanoDropTMOne;倒置顯微鏡 日本尼康公司;7500型熒光定量PCR儀 美國ABI公司;5417R型低溫離心機 德國Eppendorf公司;SyneRgy 2型多功能酶標儀 美國BioTek公司;提取機組 山東青州市精誠醫藥裝備制造有限公司;真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三七凍干粉的制備 取三七生藥1000.00 g,加入10 L水浸泡4 h。將三七浸泡液加入提取機組(80 ℃,負壓)提取,計量冷凝水體積,直至只剩1 L水液,取出。將水提液倒入冷凍盤,放入-80 ℃冰箱冷凍過夜。將冷凍盤放入真空冷凍干燥機,干燥48 h直至呈粉末狀。收集凍干粉133.56 g(產率為13.36%),密封保存,放入干燥劑,置于干燥處備用。

1.2.2 細胞分組及給藥 脫頸處死C57BL/6小鼠,浸泡于含有75%乙醇的燒杯中15 min,在無菌條件下,取出脾臟,研磨并使用紅細胞裂解液獲得白細胞,磁珠分選出CD4+T細胞。取生長狀態良好的CD4+T細胞,每孔加入1×105個細胞,設置空白對照組(RPMI-1640完全培養基和細胞)以及不同濃度的給藥組:三七凍干粉組(80、160、320、640 μg/mL)和三七總皂苷組(5、10、20、40 μg/mL)。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 將不同濃度的SQ和PNS分別作用于細胞,并設置空白組(僅RPMI-1640完全培養基)和對照組(RPMI-1640完全培養基和細胞)以及分別設置5組平行對照(n=5),培養48 h后每孔加入20 μL增強型CCK-8溶液,繼續于37 ℃孵育1 h,用酶標儀檢測450 nm處吸光度(A),并計算細胞活力,篩選出合適的給藥濃度。

1.2.4 上清中IFN-γ檢測 按“1.2.2”項下分組給藥將細胞培養48 h后,分離出上清液,使用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定上清液中IFN-γ的水平,嚴格按ELISA試劑盒說明書操作,并分別于450和570 nm處測OD值,計算出對應的IFN-γ濃度。

1.2.5 q-PCR檢測IFN-γmRNA、T-bet mRNA表達水平 按“1.2.2”項下分組給藥將細胞培養48 h后,使用Trizol法提取細胞RNA,嚴格按照操作說明書應用q-PCR法檢測IFN-γ和T-bet mRNA的相對表達量,結果用2-ΔΔCt表示。以GAPDH為內參。引物根據Primer5.0引物設計軟件設計,再由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列如下表1。

表1 q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR detection

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對結果進行統計分析和作圖,采用方差分析比較差異,若P<0.05,則表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 三七凍干粉和PNS對CD4+T細胞活力的影響

CCK8法是一種基于WST-8而廣泛應用于細胞增殖的快速、高靈敏度檢測的方法[13-15]。本研究選用CCK8法檢測細胞活性,篩選出最佳給藥濃度。結果如圖1所示,不同濃度的SQ和PNS對CD4+T細胞作用48 h后,與對照組比較,發現SQ的質量濃度為160、320、640 μg/mL時,其對CD4+T細胞活力無明顯影響(圖1A),CD4+T細胞分為多種亞群[8],本研究主要觀察藥物對CD4+T細胞向Th1細胞方向分化的影響,因此采用CCK8方法篩選出對CD4+T細胞活力無明顯影響的濃度進行后續的研究。而當SQ濃度為80 μg/mL時,其對CD4+T細胞有顯著抑制作用,故而不選擇該濃度而選擇160、320、640 μg/mL作為后續實驗的給藥濃度。當PNS的質量濃度為5、10、20、40 μg/mL對CD4+T細胞活力均無明顯影響,結合PNS在三七中的比例,因此在本實驗中選擇5、10、20 μg/mL作為后續實驗的給藥濃度(圖1B)。

圖1 SQ和PNS對CD4+T細胞活力的影響Fig.1 Effect of SQ and PNS on viability of CD4+T cell注:與對照組比較:*P<0.05。

2.2 SQ和PNS對細胞上清中IFN-γ水平的影響

Th1細胞能夠分泌大量的細胞因子IFN-γ[16],通過IFN-γ的含量可以反應Th1細胞的分泌活性。結果如圖2所示,與對照組比較,SQ和PNS都能顯著降低IFN-γ表達的水平(P<0.05)。IFN-γ主要由Th1細胞分泌,大量的研究均使用細胞上清中IFN-γ水平變化來表明Th1細胞分化的變化[17-18],提示SQ和PNS均能顯著抑制Th1細胞分泌IFN-γ的功能從而調節免疫平衡。

圖2 SQ和PNS對IFN-γ水平的影響Fig.2 Effect of SQ and PNS on expression of IFN-γ注:與對照組比較:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

2.3 SQ和PNS對IFN-γ mRNA、T-bet mRNA表達水平的影響

T-bet是Th1細胞的重要轉錄調節因子[19],故通過測定T-bet的表達可反映分化為Th1細胞亞群的比例。結果如圖3所示,與對照組比較,SQ和PNS均能夠顯著降低與Th1細胞相關的T-bet mRNA表達水平。T-bet是驅動Th1細胞分化的主轉錄因子[20],本實驗結果顯示T-bet表達水平的下降提示SQ和PNS可明顯抑制CD4+T細胞向Th1分化的比例。

Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ的mRNA水平變化反映Th1細胞活性的變化[21],結果如圖3所示,SQ和PNS可明顯抑制IFN-γ的mRNA水平,Th1細胞中IFN-γmRNA經翻譯過程可形成IFN-γ并分泌到胞外,提示二者均可抑制Th1細胞分泌細胞因子的活性。

圖3 SQ和PNS對T-bet和IFN-γ mRNA表達的影響Fig.3 Effect of SQ and PNS on expression ofIFN-γ mRNA and T-bet mRNA注:與對照組比較:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。

3 討論與結論

Th1細胞是一種效應T細胞,具有免疫調節作用,Th1細胞與其他Th細胞亞型處于動態平衡狀態,該狀態一旦失衡可引起免疫調節紊亂,Th1細胞異常活化可引起感染,自身免疫性疾病等[22-23]。類風濕性關節炎(RA)是目前常見的自身免疫性疾病,大量研究表明Th1細胞及其分泌的細胞因子過量是重要的致病因素[24-26]。本實驗使用CCK8法篩選出不影響CD4+T細胞活性的最佳藥物濃度,在后續實驗中探討SQ和PNS對CD4+T細胞向Th1細胞分化的影響。T-bet是Th1細胞特征性轉錄因子,IFN-γ是Th1細胞分泌的特征性細胞因子,因此二者可以分別反映CD4+T細胞分化為Th1亞群的比例和Th1細胞的分泌活性。本研究結果顯示:不同濃度的SQ及其活性組分PNS可抑制IFN-γ水平和IFN-γmRNA與T-bet mRNA,提示二者均可抑制Th1細胞的分化和活性。隨著SQ濃度升高,Th1細胞分泌IFN-γ的活性以及該細胞中IFN-γmRNA的表達水平均被顯著抑制,但二者呈現出相反的趨勢,前者抑制作用表現為劑量依賴性減弱,而后者表現為劑量依賴性增強,這可能是翻譯和轉錄過程中某一環節受到影響,其潛在的機制有待探討。Wei等[11]發現經PNS處理后,細胞因子IFN-γ的表達水平顯著下降。本研究結果與其一致,但本實驗是根據PNS在三七中的含量設置的濃度,相比較Wei等[11]的研究濃度范圍更窄。隨著PNS的濃度升高,Th1細胞分泌IFN-γ的活性以及該細胞中IFN-γmRNA的表達水平均呈劑量依賴性的被抑制,且二者趨勢一致。Th1細胞為促炎細胞,其主要分泌IFN-γ,本研究恰好說明了三七能夠抑制Th1細胞分泌IFN-γ的活性來發揮調節免疫的作用,提示其在RA中抑制異常活化的Th1細胞,有助于機體恢復免疫平衡。

目前已經有大量文獻證明轉錄因子是某些細胞發育和功能作用的關鍵因子。T-bet被認為是Th1細胞分化的主轉錄因子,因此也被認為是Th1細胞的標記物。它是由Szabo等[27]于2000年最初發現其可以推動Th0前體細胞向Th1細胞分化發育,并可顯著地提高細胞IFN-γ的表達水平。T-bet的表達依賴于STAT1信號(signal transducer and activator of transcription,信號轉導和轉錄激活因子),并可由正反饋周期介導(取決于其下游主要靶分子IFN-γ的直接作用),迅速增強其表達[28]。除了IFN-γ之外,其他蛋白質也在Th1細胞的免疫生物學中具有重要作用,包括STAT1,IL-12Rβ2,CC-趨化因子配體3(CCL3)和CXC-趨化因子受體3(CXCR3),而T-bet可以與編碼這些蛋白質的基因的啟動子區域結合干預轉錄過程[29]。因此,T-bet在Th1細胞的發育分化過程中起著重要的作用。本研究結果表明SQ和PNS均能顯著的抑制T-bet mRNA的水平,并且該抑制效果呈劑量依賴性,因此三七能夠有效抑制Th1細胞分化過程中重要的轉錄因子,從而抑制CD4+T細胞向Th1方向的分化,該作用可能與三七調節免疫平衡有關。

綜上所述,為了進一步明確三七調節免疫的機制,鑒于Th1細胞在免疫調節中的重要作用,本實驗觀察了三七和其主要活性組分PNS對Th1細胞活力、IFN-γ水平、IFN-γmRNA、T-bet mRNA表達的影響。結果表明,一定濃度的SQ及PNS可明顯抑制Th1特征性因子T-bet的表達,抑制CD4+T細胞向Th1方向的分化;其可抑制細胞IFN-γmRNA的表達,降低上清中IFN-γ的水平,提示其可抑制Th1細胞分泌細胞因子的活性,從而對免疫系統產生調節作用。上述研究結果表明,三七及其活性組分可以抑制CD4+T細胞向Th1方向的分化和Th1細胞的分泌活性,這可能是其調節機體免疫平衡的機制之一,從而防治炎癥免疫相關性疾病和亞健康狀態,這可為三七在日常保健和治療疾病中的合理應用提供依據。