油橄欖葉有效成分的提取及藥理活性的研究進展

李 楠,趙興文,郭美佳,吳 婧,姜 燕,*

(1.大理大學公共衛生學院,云南大理 671000; 2.大理農林職業技術學院食品工程學院,云南大理 671000)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬木犀科木犀欖屬,栽培品種有較高食用價值,在福建、四川、云南等地分布廣泛[1-2]。目前,國內油橄欖的栽培面積已有15000 hm2,年產鮮果6000 t,每年每棵油橄欖樹修剪和采收過程會產生超過25 kg的油橄欖葉副產物[1-2]?，F代生物技術研究發現:油橄欖葉中含有的抗氧化活性成分,如橄欖多酚、黃酮類化合物,含量高于橄欖果實和橄欖油[2-3]?，F代藥理學研究證明:油橄欖葉中的橄欖苦苷、羥基酪醇、木酚素類、黃酮類和咖啡酰苯乙醇苷類等化合物具有抗炎抑菌[4]、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和降血糖血脂等多種藥理活性[5]。油橄欖葉中含有大量具有良好藥理功效的活性成分,且隨著研究的深入,油橄欖葉提取物已逐漸應用于保健食品、醫藥和化妝品等行業。

本文從油橄欖葉活性成分的提取工藝、分離和純化技術的研究進展、油橄欖葉提取物的藥理活性以及其他增值利用加以綜述,以期為油橄欖葉資源的進一步研究與開發提供參考。

1 油橄欖葉活性成分的提取、分離及純化技術

油橄欖葉活性成分的研究一方面是針對不同油橄欖品種之間活性成分差異的分析,另外一方面集中于如何有效提取、分離和純化油橄欖葉中活性成分,拓展該類化合物的應用范圍。油橄欖品種繁多,不同品種油橄欖葉中營養及活性成分差異顯著。胡慶蘋等[6]測定了19個品種油橄欖葉中8種營養成分和3種活性成分的含量。結果表明:膳食纖維、還原糖、橄欖苦苷是油橄欖葉的特征成分,與油橄欖葉的品質密切相關。3種活性成分的平均含量分別為:橄欖苦苷(74.57±13.91) g/kg、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(2.49±0.42) g/kg、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(1.18±0.28) g/kg。耿樹香等[7]分析了云南引種的16個品種油橄欖葉樣品及13個品種的果渣樣品中的多酚含量。油橄欖葉樣品中多酚含量平均值為4.21%,果渣中多酚含量平均值為1.10%,油橄欖葉多酚含量高于果渣。

油橄欖葉活性成分常用的提取、分離和純化的方法主要有微波輔助提取、超聲波輔助提取、低壓沸騰提取、高速逆流色譜分離、大孔吸附樹脂分離純化、酶法水解等[8-9]。

1.1 油橄欖葉活性成分的提取

微波輔助提取得到油橄欖葉中的總酚、總黃酮及橄欖苦苷的含量均高于熱浸提法,且低溫或真空冷凍干燥技術可以保留提取物的活性[10]。有研究通過超聲波輔助乙醇溶液提取油橄欖葉總黃酮得率達5.83%[11],油橄欖葉總多酚得率達8.90%[12]。超聲輔助提取油橄欖葉的水提物經濃縮、醇沉后冷凍干燥為粉末,產品不易吸濕且分散性好,可后續加工為片劑或膠囊等固體制劑[13]。AlShaal等[14]也對比了超聲輔助水提及醇提油橄欖葉總多酚。油橄欖葉醇提物中總多酚的含量較高,但抗氧化性與水提物無顯著性差異,且醇提物中橄欖苦苷的含量(88.50±9.67 mg/g)高于水提物中橄欖苦苷的含量(37.60±6.84 mg/g)。油橄欖葉的干燥方法及儲存條件對橄欖苦苷提取率也有影響[15]。將油橄欖葉片經液氮研磨冷凍干燥、-20 ℃冷凍干燥或45 ℃烘干,得到油橄欖干葉片粉末,于-80、-20、4及25 ℃條件下儲存,采用超聲波提取法得到樣品提取液,并使用HPLC測定提取液中橄欖苦苷含量。結果表明:采用45 ℃烘干的干燥方式、存儲在25 ℃條件下的樣品橄欖苦苷質量分數最高,達到77.9 mg/g。Lama-Muoz等[16]采用加壓流體萃取技術從油橄欖葉中提取橄欖苦苷和木犀草苷的效率高于傳統的動態浸漬技術。油橄欖葉經過熱燙前處理技術使酶失活,經超聲波進一步處理,有利于溶劑的傳質,促進橄欖苦苷的釋放[17]。

酶法輔助提取和水解處理油橄欖葉可以顯著提高產品中活性成分的含量[18]。采用先酶解后超聲波處理的提取方式,可以破壞油橄欖葉細胞壁結構,減小提取過程的傳質阻力,提高多糖提取率(油橄欖葉多糖提取率為4.5%)[19]。羥基酪醇在油橄欖葉中主要以橄欖苦苷的形式存在,采用β-葡萄糖苷酶對橄欖苦苷進行水解,按照酶法最佳提取條件和大孔吸附樹脂最佳分離純化條件操作,羥基酪醇總油狀物得率為3.85 mg/g,純度為87.01%[2]。王強等[18]分析了7種酶對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷的水解效果。其中β-葡萄糖苷酶的水解效果最好,半纖維素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶次之,纖維素酶和堿性蛋白酶效果最差。經過酶水解后油橄欖葉提取物水解液的還原能力及清除DPPH的能力均高于VC和BHT。

1.2 油橄欖葉活性成分的分離純化

以上方法得到的是油橄欖葉的粗提物,為更有效的利用油橄欖葉的有效成分,有必要進一步對其分離和純化。李俊等[20]測定了9種大孔吸附樹脂對油橄欖葉總黃酮的吸附特性,通過HPD-300型大孔吸附樹脂,總黃酮吸附率可達到83.5%,總黃酮得率為10.19%。D-101型大孔樹脂純化后的橄欖苦苷經乙酸乙酯萃取后純度可達63.43%[21]。此外,高速逆流色譜技術可以快速分離油橄欖葉中的橄欖苦苷,純度可達到90%以上,為高效分離制備油橄欖葉橄欖苦苷提供了更有效的方法[5]。Liu等[22]利用填充床生物反應器內固定化酶技術,將油橄欖葉提取物中的橄欖苦苷轉化為羥基酪醇,橄欖苦苷的降解率約為90%,羥基酪醇得率約為70%。載體珠分別選擇了藻酸鈣、殼聚糖納米纖維及多孔陶瓷三種材料,其中,無機多孔陶瓷珠相對于有機載體成本更低,性能更好,更適合羥基酪醇的工業化生產。

為進一步對油橄欖葉提取物進行鑒定、量化和標準化,王曉杰等[23]對油橄欖葉中總多酚、總黃酮和橄欖苦苷熱浸提工藝進行放大實驗,得到提取液中的總多酚3.77 g/L、總黃酮2.85 g/L和橄欖苦苷3.03 g/L。并對脫除乙醇的提取液進行了噴霧干燥,運用AB-8大孔樹脂對粗提物純化,總多酚、總黃酮和橄欖苦苷質量分數分別從9.71%、7.22%和9.16%提高到31.65%、10.98%和20.38%,干燥后提取物粉末溶解度為9.38%。以上研究結果為油橄欖葉提取物進入保健食品行業提供了數據支持[23]。

油橄欖葉中的多酚類化合物結構及生理活性不同,如何有效地分離和純化多酚類化合物是油橄欖葉得以應用的前提。鑒于傳統提取分離純化技術存在耗時、純度低、溶劑回收率低等缺點,快速、規?；盎厥章矢叩男滦蜕V分離技術將成為今后的研究重點。

2 油橄欖葉提取物的藥理活性

油橄欖葉富含橄欖苦苷、木犀草苷、咖啡酸、芹菜苷、槲皮素和蘆丁等多種酚類化合物,具有廣泛的藥理活性[24-26],可體現在抗氧化、對心腦肝腎等器官及骨骼的保護作用、降壓降糖,同時還可改善自身免疫引發的炎癥,起到抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用[1,27]。

2.1 肝損傷的修復作用

油橄欖葉醇提物的活性成分主要是酚類、裂環烯醚萜和木酚素類,研究者們針對油橄欖葉醇提物對肝損傷修復作用的物質基礎及其主要功效成分進行了深入探討[1]。王昱[28]分析了油橄欖葉提取物干預非酒精性脂肪肝的分子機制、對酒精性肝損傷大鼠肝組織轉化生長因子-β1水平的影響?？赡苡捎谟烷蠙烊~醇提取物抑制氧化應激及炎癥反應因子釋放等,對D-半乳糖胺/脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷起到了較好的保護作用[1]。

2.2 抗糖尿病作用

油橄欖葉醇提物還可以有效改善正常小鼠糖代謝和糖耐量,降低腎上腺素、四氧嘧啶及鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠血糖,促進糖尿病大鼠分泌胰島素,并具有保護腎臟、胰腺的作用[29-30]。其作用機制可能與油橄欖葉醇提物促進體內胰島素分泌,増加機體對葡萄糖利用,減少肝內糖異生,抑制肝糖原分解,抗氧化以及減輕脂質過氧化反應對胰島β細胞的損傷有關[29-30]。油橄欖葉提取物(500、250、125 mg/kg)可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖、降低胰島素抵抗指數,升高胰島素敏感指數;給藥5周后,血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸、糖化血清蛋白含量降低,高密度脂蛋白膽固醇含量升高?？梢娪烷蠙烊~提取物在降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖、改善葡萄糖耐量及胰島素耐量的同時,可以調節血脂代謝異常[31]。Guex等[32]研究得到了同樣的結果,與對照組相比,油橄欖葉醇提物給藥組的糖尿病大鼠體重顯著下降,改善血糖含量,而且還可以減弱炎癥和代謝標志物的水平。樊瑞娜[33]以其前期篩選得到的油橄欖葉降糖有效部位為研究對象,評價了其對糖代謝關鍵酶的抑制作用,同時利用逆流色譜法分離制備了降糖有效部位中的化合物,為以油橄欖葉為原料制備降糖新藥提供了理論依據。

2.3 保護腦神經作用

油橄欖葉中橄欖苦苷對神經系統的作用也逐漸被關注,不僅能保護腦缺血再灌注損傷[34],還可降低As2O3對小鼠神經系統的毒性,其機制與影響大腦組織神經遞質基因的表達有關[35]。橄欖苦苷干預后,As2O3致小鼠的神經毒性明顯減輕,大腦組織乙酰膽堿、單胺類和氨基酸類神經遞質代謝酶基因及各神經遞質受體基因的表達水平與正常組差異不顯著[35]。橄欖苦苷對H2O2誘導的PC12細胞氧化應激損傷具有保護作用,其作用機制可能與抑制細胞凋亡有關[36]。橄欖苦苷能夠抑制H2O2誘導的PC12細胞的活力下降,降低PC12細胞的凋亡率,抑制PC12細胞內SOD及GSH-PX活力的降低,同時,橄欖苦苷可以抑制H2O2誘導的細胞凋亡蛋白Cyt-c、Caspase-3表達的上調[36]。

橄欖苦苷還可以通過增加大腦抗氧化酶的活性、降低脂質過氧化水平,從而改善阿爾茨海默病小鼠的學習記憶障礙[37]。胡光強等[38]研究表明:橄欖苦苷通過結合并抑制Aβ1-42纖維,降低Aβ1-42誘導的Neuro-2a的細胞毒性,提高細胞存活率,并預防Aβ1-42誘導的細胞凋亡。以上研究結果支持橄欖苦苷作為治療阿爾茨海默病的潛在藥物,但是橄欖苦苷在阿爾茨海默病治療的機制還有待進一步探索。Shibani Farhad等[39]證實了橄欖苦苷可預防嗎啡致大鼠空間學習障礙和記憶損傷,分子機制可能與其抑制了嗎啡致大鼠海馬CA1區神經元凋亡和氧化應激有關。

2.4 抗腫瘤及對骨骼和生殖系統的保護作用

橄欖苦苷是一種有效的抗癌化合物,能直接破壞細胞中的肌動蛋白微絲,抑制腫瘤細胞株的增殖和遷移,不可逆的包圍癌細胞,阻止其復制、運動和侵襲[40]。有研究證明,橄欖苦苷可以抑制皮膚癌變和腫瘤的生長,可能與阻止血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶的表達有關[27];可以抑制甲狀腺癌細胞增殖,可能與其抑制PI3K/Akt信號通路有關[41];可以抑制結直腸腫瘤的生長,可能與降低腸道相關IL-6、干擾素γ,TNF-α、IL-17A以及COX-2、Bax蛋白和增殖細胞核抗原蛋白的表達,下調NF-KB、Wnt/β、PI3K/Akt信號轉導以及轉錄激活因子3(STAT3)的表達有關[42]。Sepideh等[43]研究表明,250和500 mg/kg的油橄欖葉提取物口服劑量可以改進白消安引起的小鼠睪丸、精子質量及睪丸生殖細胞凋亡的損傷,但是750 mg/kg的高劑量卻加劇了該損傷。

橄欖苦苷能有效地減少牙槽骨質丟失,可能是因為橄欖苦苷降低了破骨細胞活性、炎癥以及細胞的凋亡,同時增加了成骨細胞活性[44]。400、200、100 μg/mL橄欖苦苷對破骨細胞的增殖具有明顯抑制作用,作用機制可能是橄欖苦苷破壞了破骨細胞細胞膜的完整性[45]。

橄欖苦苷不僅可以減少骨量丟失、防治骨質疏松[46],還具有抗子宮內膜癌和乳腺癌等作用,已成為預防和治療婦科惡性腫瘤的理想藥物。橄欖苦苷通過協調人乳腺癌細胞MCF-7中表觀遺傳調控因素與組蛋白去乙?；?顯著降低MCF-7的侵襲性和細胞活力,抑制細胞增殖,同時誘導MCF-7細胞凋亡[47-48]。橄欖苦苷可通過抑制炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的合成和釋放,減輕輻射誘導的炎癥反應,減輕卵巢的輻射性損傷[49]。許玉黎等[27]課題組體外實驗已證實橄欖苦苷可抑制卵巢癌SKOV3細胞的的增殖,且抑制作用呈現濃度依賴性。又進一步研究發現橄欖苦苷可能通過抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達、增強凋亡促進因子Bax的表達,從而對卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生長有抑制作用。

油橄欖葉提取物具有修復肝損傷、降糖、保護腦神經的作用,是具有潛在應用前景的降糖、輔助抗乳腺癌和卵巢癌新藥,其作用機制和臨床療效尚有待進一步驗證。

3 油橄欖葉的其他增值加工利用

3.1 油橄欖葉應用于食品加工

在地中海沿岸國家,油橄欖葉既作為傳統草藥治療疾病,還可作為普通食品食用[6]或做為膳食補充劑,現代植物療法使用油橄欖葉降血壓,并可作為利尿劑[26]。國內也有一些研究將油橄欖葉制成保健茶、油橄欖葉掛面[18]、油橄欖葉造紙,或將油橄欖葉水提取物作為還原劑和穩定劑合成銀納米顆粒[20,50]。李戴陽[51]通過黑曲霉麩曲和紅曲米的聯合發酵技術研制具有良好營養價值的油橄欖葉黑茶,其外形規整,潤澤度好;茶湯呈紅濃色,香氣濃郁,滋味醇厚。方成鑫等[52]研究了西昌產5個品種油橄欖茶的黃酮類及多酚類成分,油橄欖茶中橄欖苦苷含量高,VE含量相對較低。也有研究分析了云南永仁27個品種的油橄欖葉茶的鋅、鐵、銅等礦物質元素含量,為云南油橄欖高值化產品的開發提供一定的理論基礎[53]。

李春燕[2]在研究了油橄欖葉中羥基酪醇的提取分離純化后,又進一步優化了油橄欖葉酒最佳釀造工藝為:添加4%酵母在初始糖度10%、初始pH為3.6、主發酵溫度25 ℃的條件下發酵6 d。橄欖酒具有油橄欖的特殊風味,且酒體良好,無沉淀,滋味純正。馬騰臻等[54]以制取橄欖油后的果汁為原料,通過調配、發酵等工藝制得油橄欖酒,并鑒定出69種香氣成分,總含量約23.44 mg/L,主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創木酚。該方法在繼油橄欖枝葉和果渣中有效成分的提取后進一步完善了油橄欖綜合開發利用體系。

3.2 油橄欖葉提取物應用于食品貯藏保鮮

油橄欖葉提取物還可用于食品及農產品的貯藏保鮮。Khalifa等[55-56]將油橄欖葉提取物及果渣提取物添加到殼聚糖保鮮膜中,應用到蘋果和草莓的貯藏。該保鮮膜有效抑制了擴展青霉和匍枝根霉的生長繁殖,有效降低了蘋果和草莓的腐爛率。其中,殼聚糖與2%油橄欖葉提取物復合涂膜有效的降低了蘋果在儲藏期間的失重率。Amaro-Blanco等[57]將添加了油橄欖葉提取物的活性包裝結合真空處理,應用于伊比利亞腌制豬肩肉的保藏,起到了很好的保藏效果。油橄欖葉提取物橄欖苦苷對核桃油也有較強的抗氧化和清除自由基的能力,將265 mg/kg橄欖苦苷、135 mg/kg檸檬酸和197 mg/kg VC復配,對核桃油的抗氧化穩定性有較好的增效作用[58]。

4 結語

油橄欖葉中富含的天然活性成分具有廣闊的前景,可應用于藥品、化妝品、保健食品和功能性食品[59]。目前,油橄欖葉提取物的研究和利用水平仍不充分,后續可從以下幾方面進行研究:油橄欖葉提取物的高效提取工藝和穩定性研究[60];油橄欖葉提取物的分離純化和結構鑒定;油橄欖葉提取物多種活性成分的協同作用[26],藥理活性的作用機制和臨床療效尚有待進一步探究;進行油橄欖葉提取物相關功能性產品的開發應用。隨著研究的深入,油橄欖葉提取物的保健功能將得到充分發揮,油橄欖葉也能得到更加完善的利用。