原花青素生理功能及其與腸道微生物相互作用的研究進展

扶曉菲,鄢明輝,游春蘋

(光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海乳業生物工程技術研究中心,乳業生物技術國家重點實驗室,上海 200436)

原花青素(proanthocyanidins,PACs)又被稱作濃縮單寧或濃縮鞣質,是食物中較為常見的一大類類黃酮化合物,具有植物化學活性[1]。PACs主要由兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素等單體(黃烷-3-醇)聚合而成,一般根據單體的聚合度(DP)分為低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPC,PD=2～10)和原花青素高聚體(proanthocyanidins polymers,PPC,PD>10)兩大類,依據聚合度也可將其分為游離態PACs和結合態PACs,其中原花青素二聚體作為一種游離態多酚,憑借其良好的水溶性,易被人體吸收而被廣泛研究[2]。水果(蘋果、葡萄、蔓越莓等)、蔬菜、種子、果皮、堅果、茶葉、紅酒等食品提供可觀的膳食來源PACs,在人類膳食結構中舉足輕重。PACs作為高效天然抗氧化劑的同時,兼有抗菌抗炎、抗腫瘤、預防心血管疾病及其代謝綜合征等作用[3-4]。

受現有的分離提取手段的局限,首先PACs的提取技術的開發與優化仍然是研究的重點與難點,其次極少數的游離態PACs雖可經胃和小腸直接吸收,但大量結合態的PACs卻在胃和小腸中表現出較低的生物利用度,需要到達結腸經由腸道微生物解離、水解生成游離的PACs才可發揮生理作用[5-7]。研究指出,消化道是食源性PACs促進人體健康作用的關鍵靶器官,聚合度較高的PACs會到達結腸腔內,經腸道微生物代謝成相應單體及芳香酸等營養物質被小腸、心臟、肝臟等組織利用,此外PACs還充當著益生元的作用,對乳酸菌、雙歧桿菌、產丁酸鹽細菌等腸道微生物的生長起促進作用,二者間的雙向調控既提高了PACs的生物利用率又有助于腸道有益菌的生長。

目前關于二者相互作用的研究較為少見,但不可否認該研究具有深遠的應用價值[6,8-10]。一方面,基于PACs作為高生物活性的膳食多酚重要來源這一事實,本課題的研究對于進一步解決PACs低吸收率問題及擴大PACs的廣泛應用而言十分必要;另一方面該研究也探究了腸道微生物對包括PACs在內的膳食多酚的重要作用,豐富了腸道微生物的研究領域。本綜述通過比較PACs與花青素的異同點來歸納PACs的生理活性、綜述其與腸道微生物相互作用,試圖為該作用在諸多慢性疾病中發揮的潛在作用研究提供理論參考,一定程度上也是對飲食療法的補充和總結。

1 原花青素與花青素

PACs和花青素不盡相同,實際上PACs是花青素的前體,因此也被稱作前花青素,經由MYB轉錄因子互作等途徑生成花青素[11]。PACs和花青素同屬類黃酮類植物化合物,都是食源性的天然抗氧化劑,但也可從化學結構、顏色及分布、代謝方式、應用途徑差異等幾個方面來加以區分[1,12]。

從化學結構來看,PACs是由不同種類及數量的以2-苯基色原酮為母核,經衍生形成的單體結構(也即黃烷-3-醇),借助各單體間不同形式的C—C鍵(或兼含C—C鍵和C—O—C鍵)聚合而成的一大類不同聚合度、不同空間構型、可被酯化、甲基化的多酚類物質。花青素則是以2-苯基色原烯為母核衍生而得的類黃酮化合物存在,極少以游離形式存在,常借助糖苷鍵與糖形成花色苷并存在于植物中[4,12-13]。常見PACs二聚體和花青素的一般化學結構見圖1。PACs自身多呈無色至棕色,參與植物種皮、果皮等的著色,多使之呈現褐色,而花青素作為一種水溶性色素,使得黑枸杞、黑莓、葡萄、草莓等植物呈現豐富的顏色,如藍色、紫色、紅色、粉色等,并在不同的環境中出現顏色藍移或紅移的情況[14]。花青素的主要代謝場所是胃和小腸,最終以花青素或其代謝物的形式排出體外,OPC遵從同樣的代謝途徑,而PPC一般經結腸經微生物分解代謝后輸送至其他組織[8,12]。此外,二者的應用領域不一致,PACs目前主要應用在藥品、保健品、食品防腐劑等方面,而花青素基于天然色素和抗氧化性這兩個特性,在保健品、化妝品、食品添加劑等領域有所應用[12]。

圖1 原花青素和花青素的常見化學結構Fig.1 Common chemical structures ofproanthocyanidins and anthocyanins

2 原花青素的主要生理功能

2.1 抗氧化作用

抗氧化及清除自由基是PACs等膳食多酚最顯著的的生理特性,既有文獻表示可可、葡萄籽副產品、脂溶性葡萄籽PACs(grape seed proanthocyanidins,GSP)等提供了大量的PACs,可與生物體內其他分子相互作用而產生抗氧化、抗炎等功效,有望成為新型抗氧化劑[15-16]。PACs抗氧化應激的研究,也歷經了從作用機制上升至臨床應用的過程,通常認為PACs通過減少DNA損傷、絲裂原活化蛋白激酶、脂質過氧化作用及增加Nrf2轉錄因子,調控其他途徑而達到防控心血管疾病、神經退行性疾病、代謝性疾病、皮膚病、癌癥的目的[3]。紫外線(ultraviolet light,UV)是一項重要危險因素,它會引起DNA損傷、引發免疫抑制,進而導致皮膚癌,研究指出富含PACs和綠茶多酚等的膳食制劑,可修復DNA損傷并介導UV誘導的免疫抑制過程,從而具有抗輻射及光保護作用[17]。對于d-半乳糖誘導的衰老模型小鼠,Xiao等[18]借助水迷宮和空間記憶測試,血漿代謝組學分析,輔以腸道微生物群檢測等綜合性手段,得出長達7周的PACs治療可通過調節機體代謝途徑來預防小鼠認知下降及氧化損傷的結論。中樞神經系統損傷引起的腦水腫同樣是誘發疾病乃至致死的重要危險因素,一項將30只雄性大鼠分別分為對照組、創傷組和治療組的動物實驗,實驗組經顱骨切除和冷損傷后檢測腦含水量,結果證實PACs可以有效減少實驗性創傷后的氧化應激,具有抗腦水腫作用[19]。

2.2 抗菌抗炎作用

PACs的另一個典型特征是抗炎殺菌,憑借較好的抗粘附特性在減輕水腫,防治類風濕性關節炎、尿路感染(urinary tract infection,UTI)、胃粘膜感染、口腔感染,預防類抑郁行為等中體現出潛在價值[20]。類風濕性關節炎是一種引發機體軟骨、骨骼、滑膜等組織產生慢性周身性炎癥,引起多器官損傷,進而慢性致殘的疾病,常規藥物治療效果欠佳且價格昂貴、副作用明顯,一項近期研究成果提出,源于墨西哥雨林灌木的富含PPC的提取物,經作用于CD-1雌性小鼠9 d,發現PPC介導了白細胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-17和IL-6濃度的降低和腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的減少,同時測得小鼠的炎癥抑制率高達72%,表現出了PPC良好的抗炎特性[21]。蔓越莓PACs(Cranberry proanthocyanidins,c-PAC)應用于緩解男性睪丸外感染癥狀、預防女性的復發性UTI有著幾十年的歷史,既有報道認為c-PAC這一生物活性發揮可能多依賴其特有的“A型”黃烷鍵。美國一項相關研究對具有復發性UTI病史的182名婦女隨機分組,實驗組持續6個月每日服用500 mg的全蔓越莓果粉(PACs含量為0.56%),在發現各組的生化參數無基本差別的基礎上,UTI復發率較對照組(25.8%)顯著減少,只有10.8%,表現出了PACs降低復發性UTI的巨大潛力[22-23]。此外,PACs抗炎抗氧化功能的應用也拓展了到其他方面,有報道指出神經炎癥和細胞因子水平的升高與抑郁癥之間存在相關性,PACs可以通過強效的抗炎作用來抑制脂多糖誘導的小鼠類抑郁行為,有望成為潛在有效治療劑[24]。

2.3 抗腫瘤作用

近年來PACs的潛在抗腫瘤作用也成為了研究熱點。借助上調NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)來介導氧化應激過程,進而增加非小細胞肺癌細胞的遷移,是吸煙致癌的關鍵機制,GSP對腺癌人類肺泡基底上皮細胞(A549)的體外實驗結果顯示,GSP借助影響NOX關鍵組分的蛋白水平介導氧化應激,借助減少上皮間質轉化控制了香煙煙霧冷凝物誘導的細胞遷移,具有潛在的預防及治療肺癌的作用[25]。肝細胞癌也是一種常見肝癌類型,前期癥狀不明顯且術后5年生存率不高,影響人類生活健康。血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)是一種新型血液供應模式,其潛在機制有望為肝癌治療的潛在靶點,一項以不同劑量的GSP分組作用于H22肝癌模型小鼠的研究表示,GSP以劑量依賴的方式有效抑制了VM結構,可能成為有效的抗VM藥物[26]。近年來食管癌的發生率呈上升趨勢,術后5年生存率同樣不容樂觀,其中膽汁和胃酸回流是食管癌的重要誘因。研究指出c-PAC對食管癌潛在治療機制包括激活自噬機制和抑制膽汁酸代謝等,這一機制同時起到了逆轉腸道微生物失調的作用[27]。Toden等[28]借助系統性的體外內等實驗證實了OPC對結直腸癌的保護作用,同時提出了一種新型結腸癌預防機制,包括降低LGR5、CD44和CD133在內的腸癌干細胞標志物的表達,下調關鍵轉錄因子YAP、TAZ等實現干擾癌細胞發育和自我更新。馬尾松皮中提取的PACs(Pinus massoniana Bark proanthocyanidins,PMBPs)和GSP被證明分別對卵巢癌[29]和宮頸癌[30]發揮積極作用,且保護機制高度一致,即借助線粒體相關凋亡通路的激活發揮作用,詳細作用機制包括線粒體膜電位的丟失、抗凋亡蛋白Bcl-2的下調及Caspase 3、Caspase 9等抗體的活化。PACs的主要生理功能及常見應用見表1。

表1 PACs的主要生理功能及其應用Table 1 Major physiological functions and application of PACs

2.4 防控心血管疾病及代謝綜合征

PACs作為一種膳食生物活性物質,在諸多常見慢性疾病的調節中發揮著特定的生理功能。既有報道推薦攝入PACs等黃烷醇化合物,認為其既降低了健康危險因素,又具有防治心血管疾病和延緩衰老的保護作用,PACs的生物活性與人體營養和健康之間的廣泛相關性值得進一步探究[31]。Lee等[32]指出,PACs的A2型(PA2)代謝物具有較好的預防動脈粥樣硬化的潛力,其潛在作用機制可以概括為PACs的主要微生物代謝物5-(3′,4′-二羥基苯基-γ戊內酯)(DHPV),較PACs或其單體具有更好的防治效果,多借助下調導致動脈粥樣硬化的生物標志物如血管細胞粘附分子等,減少TNF在血管細胞上的粘附而發揮保護作用。臨床數據顯示PACs對葡萄糖穩態起調節作用,較高劑量的PACs攝入被報道與糖尿病風險的降低相關[33]。一項針對高脂肪飲食誘導的糖尿病大鼠的研究指出,服用16周500 mg/kg劑量的GSP大鼠,其坐骨神經游離鈣離子濃度顯著降低,同時Ca(2+)-ATP酶活性有所提高,提示了GSP具有預防大鼠周圍神經的早期功能和形態學異常的作用[34]。Wang等[35]歸納了PACs防治2型糖尿病及其并發癥如高脂血癥和調節腸道菌群的機制,包括葡萄糖吸收的促進、脂質分解的抑制及胰島素穩態的調節等。一種較為公認的預防糖尿病、肥胖等慢性疾病的策略是抑制目標消化酶,低聚合度PACs是一種很好的消化酶抑制劑,具有預防肥胖及減重的可能[2]。研究發現[36],與喂食普通飼料相比,經高脂肪膽固醇飲食喂食的家兔體重、胰島素抵抗、肝指數等指標相對較高,用PACs的B2型(PB2)治療12周后,經處死檢測其血清生物標志物并評估其肝臟的組織學參數表明,PB2治療有效防止了因高脂肪膽固醇飲食引起的體重增加、高甘油三酯血癥、肝臟甘油三酯積累。高血壓病理生理學的一個重要生理指標是心血管重構,經GSP治療的DOCA鹽誘導的SD大鼠,血管調節因子內皮素-1(endothelin-1,ET-1)釋放減少,證實了GSP通過抑制活性氧/絲裂原活化蛋白激酶通路,進而對由心血管重塑引起的血壓升高產生保護作用[37]。另外一種潛在機制認為,País葡萄來源的PACs具有抑制血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的作用,提示了其作為天然抑制劑的潛在機制[38]。此外,OPC也被報道改善了小鼠心血管重塑指數和氧化應激狀態,在孕鼠高血壓的防治中發揮較好的療效,為臨床應用提供了治療方向[39]。

2.5 其他作用

Choi等[40]還報道了PACs借助抑制肥大細胞的活化機制介導了小鼠的過敏反應。除此之外,PACs作為一種強效自由基清除劑,可通過抑制氧化應激對常見化療藥物阿霉素造成的腎臟毒性發揮保護作用[41],同時也使得暴露于由結腸微生物群產生的甲酚的結腸上皮細胞,細胞活力得到改善,免受甲酚的損害[3]。PACs的主要生理功能及其應用見表1。

3 原花青素與腸道微生物的相互作用

3.1 腸道微生物對原花青素的積極影響

PACs與腸道微生物相互作用的研究尚不多見,一般認為,PACs生物利用率的提高及應用范圍的擴大,離不開消化道中腸道微生物作用下的代謝途徑的加快及抗氧化應激能力的提高,一定程度上PACs的吸收與代謝依賴于人類消化的微生物種群變化[42]。人腸道微生物具有將PA2、PB2、c-PAC分解代謝成苯甲酸、2-苯乙酸、3-苯丙酸等多酚化合物的能力,這些微生物代謝物對PACs生物活性的提高具有促進作用,既對PACs的生物利用度的改善做出了貢獻,又為其在人類健康中的應用提供了新視角[43-44]。

經由腸道微生物代謝的PACs在免疫力下降、衰老、記憶障礙、胃炎、動脈粥樣硬化等癥狀及疾病中都體現出保護潛力。PACs預防衰老作用機制的研究指出PB2在改善小鼠氧化損傷的同時伴隨著厚壁菌門/擬桿菌門比值、雙歧桿菌豐度的顯著變化,腸道菌群的重塑提示了機體代謝途徑的調節可能介導了抗衰老過程[18]。蓮蓬PACs(LSPC)已被報道具有增加記憶的作用,研究指出乳酸菌(Lactobacilluscasei-01,LC)分別與低、高劑量LSPC組合作用于模型小鼠20 d后,借助Y-迷宮測試評估小鼠的學習和記憶能力,得出高劑量實驗組(H-LSPC與LC組合作用)的測試錯誤率分別較對照組(H-LSPC組、LC組)減少了41.59%和68.75%,LSPC和LC的組合通過提高總抗氧化能力水平等增強了LSPC的生理活性,從而達到改善學習記憶障礙、促進記憶增強的目的,腸功能也被報道借助上述雙向作用而得到調節[45]。近期相關研究也指出PACs在抗炎有了新應用,由于調節胃上皮IL-8是減輕胃炎及預防其惡化的有效手段,實驗發現分離自板栗的PACs可以借助破壞NF-κB信號傳導和其他機制來抑制IL-8的分泌,這一實驗結果為潛在抗胃炎類營養保健品的開發提供了生物指導思路[46]。此外,益生菌如鼠李乳桿菌促進了c-PAC的生物轉化和代謝,其代謝產物4-羥基苯乙酸、水肉桂酸等也顯示出增強肝癌HepG2細胞的體外抗癌活性,有助于PACs更好的發揮藥理活性[47]。

3.2 原花青素對腸道微生物的積極影響

PACs對腸道微生物的影響主要通過增加微生物多樣性、調節腸道穩態、提高氧化應激能力等來體現,其作用機制尚不完全明確,總體表現為通過增強雙歧桿菌、乳酸菌、阿克曼菌(AKK)等益生菌,并抑制部分腸道有害菌群來改善腸道菌群、增強腸道屏障功能和維護結腸健康。已知PACs飲食干預與抗生素喂養干預具有差異性,實驗發現與僅用抗生素干預的飲食組相比,經PACs和抗生素先后分別喂養巴馬小型豬各1個月,借助16S rRNA測序發現,豬腸道微生物群豐富度指標(Chao 1)上升,而螺旋菌屬和纖維桿菌門要明顯較抗生素組低,提示其作為替代抗生素的潛在可能性[48]。Han等[49]肯定了GSP作為潛在抗生素替代物的價值,并指出GSP通過作用于腸道微生物,提高了斷奶仔豬抵抗腸道氧化應激而發揮改善黏膜屏障的作用。一項關于葡萄籽PACs復合提取物(GSPE)作用于雌性大鼠的研究,既觀察到腸道中厚壁菌門/擬桿菌門比例的下降,也發現與飽腹感相關的腸激素如血漿胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的顯著增加,大鼠在飽腹感保持不變的前提下,能量消耗增加、食欲減少,提示了PACs對腸道菌群的作用也可能介導其生理作用,改善葡萄糖耐受性進而起到預防糖尿病和肥胖的作用[50]。

同樣,PACs對腸道微生物作用的應用主要體現在降低炎癥反應、保護心臟代謝、改善肥胖及糖尿病等代謝代謝綜合征中。例如,基因工程改良蘋果中提取的PACs作用于健康小鼠后,實驗組中觀察到炎癥標志物PGE2、Il2rb、Ccr2、Cxcl10和Ccr10的顯著降低,同時總細菌數較對照組提升6%,表現了PACs通過調節腸道微生物群來介導全身抗炎作用[51]。其次,Blumberg等[52]綜合蔓越莓相關研究進展指出,c-PAC與其他蔓越莓成分和腸道微生物群之間的具有協同作用,這一作用不僅體現在c-PAC的抗炎功能方面,也表現在調節血脂、血壓、內皮功能、血糖等,為蔓越莓對心臟代謝健康產生的良好效果供了更多的證據。在GSPE調節高脂飲食誘導的小鼠體內實驗中,16S rDNA分析結果表明,GSPE的補充調節了腸道微生物群組成,同時顯著降低TNF-α、IL-6等炎癥因子的血漿水平,進而改善了胰島素敏感性,其作為潛在益生元劑能夠靶向腸道微生物菌群,為代謝紊亂的預防和治療提供可能性[53]。以上類似結論也在絕經模型小鼠實驗中被證實,表明GSPE成為預防肥胖、改善絕經后婦女生理失調的潛在功能性食品[54]。總而言之,PACs與腸道微生物具有積極的雙向調節作用,并在諸多常見慢性疾病的防控已有所體現。

3.3 原花青素對腸道有害菌的抑制作用

報道也指出,PACs對腸道微生物的調控作用也表現在對沙門氏菌、假單胞菌、奇異變形桿菌、致病性大腸桿菌等腸道有害菌、食源性致病菌等的生長抑制。分離得到的澀柿PACs八聚體,經作用于沙門氏菌并研究其毒力分泌系統發現,PACs不影響細胞的生長,但對抑制致病性毒力蛋白 SPI1的分泌產生抑制作用,表現出良好的抗菌潛力[55]。PACs對阪崎克羅諾桿菌的抑菌作用尚不明確,Joshi等[56]借助藍莓PACs與等體積的阪崎腸桿菌混合培養0.5、1.0和6.0 h,1 h后測得,實驗組菌株減至不可檢測水平,同時結合對照組的掃描電鏡研結果發現,經處理菌株的細胞膜形態方面存在差異,表明藍莓PACs對阪崎克羅諾桿菌感染存在預防和治療潛力。尿路感染通常與生物膜的形成直接相關,一項綜合結晶紫生物膜染色、重氮素代謝測定、共聚焦成和質譜分析等技術來檢測PACs破壞銅綠假單胞菌生物膜形成的能力的研究指出,c-PAC降低了銅綠假單胞菌的群集運動,且在蛋白表達方面呈現顯著差異,具有抗銅綠假單胞菌的生物膜特性的可能性[57]。基于絕大部分尿路感染由致病性大腸桿菌(UPEC)和奇異變形桿菌引起且PACs可在其中發揮良好價值這一前提,一組衡量 c-PAC對UPEC和奇異變形桿菌體外抗粘附活性的實驗得出,UPEC不僅運動性和脲酶活力降低,且伴隨著對HT1376細胞系和奇異變形桿菌粘附力的顯著下降(高達75%),顯示出較強的泌尿抗粘附活性[57]。

3.4 其他影響因素

體外實驗結果顯示,常見乳酸菌和荔枝果皮PACs的相互作用具有雙向調控作用,PACs可以有效調控ST-01和L.casei-01為代表的乳酸菌的生長,反之乳酸菌也對PACs的代謝起促進作用,低聚糖、可溶性膳食纖維、ω-3脂肪酸等營養物質在其中發揮積極作用[58-59]。PACs和益生菌制劑的聯合補充,既顯示出了對感染產毒大腸桿菌小鼠腸道損傷的改善作用,又具有抑制腸外UPEC外入侵腸上皮細胞的能力[60-61]。同時,富含PACs的飼料被廣泛應用于預防牧草氣脹病,研究發現ω-3多不飽和脂肪酸與低劑量的PACs存在協同作用,促進了飼料基質中腸道微生物介導的PACs生物轉化[62]。此外,諸如高糖高脂等飲食結構和食物加工方式也會干預PACs在動物或人體中的代謝效果,是二者相互作用的重要影響因素[63-64]。同時相關研究也指出,蘋果基質中PACs細胞壁的相互作用則使人腸道微生物群對PACs的代謝降低,進而導致微生物代謝物作用下的抗炎效果下降[65]。

4 結語

PACs是一種廣泛存在的天然多酚物質,經臨床研究證實其副作用極低,較為安全[66],同時也憑借保健或藥理作用的多樣性,對多類慢性疾病具有潛在防治的作用,并有望在食品添加劑、膳食補充劑、保健品、藥品的研發中發揮潛在價值。基于以上內容,存在如下問題需要明確:第一,樣品獲取有難度,分離提取技術的精進依舊是阻礙PACs深入研究的重要因素,諸如植物中不可提取多酚的提取分析方法的開發值得關注[5];第二,研究方法不全面,既有報道中實驗結果多借助動物體外實驗得出,有待進一步擴大研究對象及數量,借助更深層次的臨床實驗來證實;第三,研究及應用領域有待拓展,例如PACs在神經系統相關疾病的應用尚少,只在預防衰老、認知障礙、類抑郁行為等的方面有少許報道,有待廣泛探究PACs對神經退行性疾病甚至是各類常見慢性疾病的影響。總之,二者相互作用的研究值得肯定,它不僅對研究對象本身具有雙向的積極意義,同時也必將帶動PACs相關生理功能與具體病癥相關性的廣泛研究,為防控各類不良癥狀和慢性疾病提供客觀可能性。