膠質瘤中BRAF基因異常的研究進展

孫夢雪 王雷明 滕梁紅

(首都醫科大學宣武醫院病理科,北京 100053)

膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤類型，占原發顱內腫瘤的50%～60%，近年來發病率正在呈現逐步上升的趨勢[1]。由于顱內腫瘤部位的特殊性，在膠質瘤治療手段的選擇上受到很大限制，治療效果也差強人意。目前，隨著對腫瘤分子水平研究的不斷深入，越來越多的分子遺傳學特征在腫瘤的診斷、治療及預后評估等方面發揮重要的指導作用[2]。絲氨酸/蘇氨酸激酶v-RAF鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1(the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1，BRAF)基因異常是較為常見的腫瘤相關性分子改變，其中BRAFV600E點突變在包括甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤、結直腸癌、毛細胞白血病等多種腫瘤中均被檢測到，并且已經成為重要的治療靶點[3]。而近些年來，在一些特殊的膠質瘤類型中也陸續發現了BRAF基因的異常，這其中除了常見的BRAFV600E點突變，還包括BRAF基因融合[4]。這些發現為膠質瘤的診斷及綜合治療提供了新的手段和方向。本文將目前BRAF基因異常在膠質瘤診斷和治療中的應用進展做一綜述。

1 膠質瘤中BRAF基因的異常

BRAF基因位于染色體7q34，與ARAF基因及CRAF基因共同構成了RAF基因家族。其編碼的BRAF蛋白參與肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)-RAF-絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase，MEK)-細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)-有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK),即RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路的調節。MAPK通路開始于跨膜受體酪氨酸激酶的活化，并通過與酪氨酸激酶受體結合以及自磷酸化激活RAS，進而激活RAF及下游的MEK1/2,最終導致ERK1/2轉錄復合物的激活，引起細胞的增生及腫瘤的發生。但另一方面，當該通路下游的抑癌基因p16INK4a、p19ARF、p53 和PTEN等發揮作用時，又可以引起細胞的分化及衰老。當BRAF基因出現異常時，不需要RAS的活化就可以激活下游的信號分子，MAPK通路持續活化，該機制被認為與包括膠質瘤在內的多種腫瘤的發生均有關[5]。目前已知的與膠質瘤相關的BRAF基因異常主要包括BRAF突變和BRAF融合。

BRAFV600E突變是一種錯義突變，是第600位的谷氨酸替代了纈氨酸，這也是BRAF突變最常見的(約占90%)一種突變形式。BRAFV600E突變導致高水平的BRAF激酶活性和高水平的磷酸化和活化ERK，使MAPK通路持續激活，促進腫瘤的發生。BRAFV600E突變激活MAPK 信號的能力與RAS活性無關。事實上，在BRAFV600E突變的細胞中發現RAS活性水平被抑制，這是由于下游的ERK被激活，產生強烈的負反饋所致[5]。

BRAF的融合在2008年才被首次報道[4]。Jones等[4]描述了1例毛細胞星形細胞瘤中位于7q34上2Mb的串聯重復序列，并證實是BRAF與同在一條染色體上的基因KIAA1549之間出現了融合。BARF與KIAA1549最常見的融合位點是KIAA1549的16號外顯子和BRAF的9號外顯子融合，其次還有15-9和16-11等方式。隨后研究者[4，6-7]發現BRAF基因融合時，RAF的N端可以被KIAA1549、FAM131B、SRGAP3或GTF2I等替代，RAF的N端自抑制域丟失，解除了對C末端結構域的抑制，使MAPK通路異常激活，隨后，Shin 等[8]在小鼠模型上又發現，C末端激酶結構域本身的激活可能還不足以具有致瘤性，但協同 Ink4a(p16)/Arf(p14)的丟失卻可導致膠質瘤的發生。

2 BRAF V600E基因突變在膠質瘤中的意義

BRAFV600E基因突變是腫瘤中比較常見的分子改變，發生于人類約7%的惡性腫瘤，包括毛細胞白血病(幾乎100%)、黑色素瘤(約45%)、甲狀腺乳頭狀癌(約45%～70%)、結直腸癌(8%～15%)及非小細胞肺癌(2%～5%)等[3]。在一些中樞神經系統腫瘤，如膠質瘤、腦膜瘤、乳頭型顱咽管瘤中也較為常見。在膠質瘤中,BRAFV600E突變主要發生在一組異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)野生型的膠質瘤，包括毛細胞型星形細胞瘤(pilocytic astrocytomas,PA)(12.5%)、節細胞膠質瘤和間變型節細胞膠質瘤(ganglioglioma，GG)(50%)、多形性黃色星形細胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma，PXA)(約55%)、上皮樣膠質母細胞瘤(epithelioid glioblastoma,eGBM)(58%)等[9-10]。詳見表1。值得注意的是，在這組腫瘤中，除了毛細胞型星形細胞瘤以外，BRAFV600E突變主要見于一組形態上以上皮樣細胞為特征的膠質瘤(間變性GG、PXA、間變型PXA和上皮樣膠質母細胞瘤)。這幾種腫瘤的組織學級別及預后不一，但在形態及分子特征上卻存在一定的相似性，而且陸續出現了一些它們之間存在相關性的報道。Tanaka等[11]曾報道了1例具有BRAFV600E突變的PXA患者手術后13年發展成eGBM，另一項研究[12]中也報道了1例由間變型PXA發展成eGBM的病例。關于PXA和GG的相關性也有報道，如Cicuendez等[13]及王雷明等[14]均報道過混合性PXA-GG的病例，也提示兩種腫瘤可能存在一定的同源性。2018年Murakami等[15]首次報道1例具有上皮樣細胞的間變型節細胞膠質瘤，上皮樣細胞和神經節樣細胞均檢測到BRAFV600E突變，因此認為節細胞膠質瘤可能是上皮樣膠質母細胞瘤的前驅病變，這些形態學和分子層面證據的出現也提示這幾種腫瘤可能屬于同一疾病譜系。由于BRAFV600E突變在世界衛生組組(World Health Organization， WHO)I～IV級的多種膠質瘤中均可出現，因此在鑒別診斷中的意義有限，但在一些特定情況下卻對病理診斷很有幫助。例如：在低級別的彌漫性膠質瘤(WHOⅡ級 )累及大腦皮質時，需要和節細胞膠質瘤(WHOⅠ級)進行鑒別，如果存在BRAF的突變，則支持后者；PXA(WHOⅡ～Ⅲ)或上皮樣膠質母細胞瘤和巨細胞膠質母細胞瘤(WHO Ⅳ級)都可以出現胞質豐富的上皮樣細胞，但巨細胞膠質母細胞瘤通常不具有BRAF的突變[16]。

檢測BRAFV600E突變在預后方面的價值主要體現在兒童膠質瘤中，目前研究者[17]認為BRAFV600E突變是一種預后相對較差的標志物，比如發生于腦干BRAFV600E突變的GG(WHOⅠ級)復發率要高于野生型；兒童間腦BRAFV600E突變的低級別膠質瘤更具侵襲性，尤其是13歲以下的兒童[18]。但是也有研究者發現在兒童中線的膠質瘤中,當存在H3K27M和BRAFV600E雙重突變時，相對于H3K27M單一突變的彌漫中線膠質瘤，患者具有更長的生存期[19]。因此對于同一病例中同時出現多個基因改變的臨床意義尚需更多的研究和數據。

表1 膠質瘤中BRAF基因的異常改變[9-10]

BRAF： the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1；WHO： World Health Organization；PA: pilocytic astrocytoma；GG:ganglioglioma；PXA: pleomorphic xanthoastrocytoma；eGBM: epithelioid glioblastoma；PMA: pilomyxoid astrocytoma；DLGNT: diffuse leptomeningeal glioneuronal tumor.

對于存在BRAFV600E突變的膠質瘤，已經有研究者[20-21]嘗試將其作為治療靶點進行靶向治療。如BRAF抑制劑維羅非尼(Vemurafenib)和達帕菲尼(Dabrafenib)已被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration， FDA)批準用于BRAFV600E突變的晚期惡性黑色素瘤患者[20]。Kaley等[21]的研究表明Vemurafenib對BRAFV600E突變的膠質瘤患者具有較持久的抗腫瘤活性，但在不同的組織學類型中治療效果不同，其中以PXA患者治療效果最好。此外，也有單獨應用Dabrafenib成功治療BRAFV600E突變膠質瘤以及復發性惡性膠質瘤的個案報道[22]。同時有研究[23]結果顯示對于BRAF抑制劑耐藥的患者，MEK抑制劑曲美替尼(Trametinib)聯合BRAF抑制劑Dabrafenib可以克服單藥治療的耐藥性。

3 BRAF基因融合在膠質瘤中的意義

BRAF基因融合最常見的配體是KIAA1549基因，該基因目前的功能尚不明確，但兩者可以通過串聯重復導致KIAA1549-BRAF融合。膠質瘤中，KIAA1549-BRAF融合主要發生在毛細胞型星形細胞瘤(>70%)及彌漫性軟腦膜膠質神經元腫瘤(75%)，其他常見的還包括毛黏液樣型星形細胞瘤(40%～50%)和節細胞膠質瘤(18%)。詳見表1。PA中最常見的KIAA1549-BRAF融合形式是 16-9外顯子融合，且多發生于小腦，而外顯子15-9融合常出現在中線部位[24-25]。有研究者[26]認為BRAF基因融合形式與組織病理學形態存在相關性，KIAA1549-BRAF融合與PA中毛細胞形態有一定的聯系， 外顯子16-9融合更容易形成雙相模式，而外顯子15-9融合更多見于富于黏液的腫瘤。KIAA1549-BRAF融合在PA中的高檢出率，在PA與兒童低級別彌漫性膠質瘤的鑒別診斷中發揮了重要作用[27]。此外，目前的研究[25]也顯示，KIAA1549-BRAF融合的膠質瘤傾向于更長的無進展生存期。另有研究[28]表明應用KIAA1549-BRAF融合的高檢出率有助于PA的進一步研究，比如有研究通過激光顯微切割，獲得PA患者手術切除標本中增生的微血管成分和腫瘤細胞成分，分別檢測KIAA1549-BRAF融合，結果提示增生的微血管的某些細胞成分可能與腫瘤細胞具有同一起源。BRAF基因融合的配體除KIAA1549外，近幾年還陸續發現一些其他的配體基因，如eFAM131、SRGAP3、RNF130、CLCN6、MKRN1、GNAI1、GTF2I等，不同的配體在腫瘤發生過程中的作用可能有所差別，但目前由于發現其他配體的多是個案報道，尚無法判斷其對膠質瘤發生、發展及預后的影響差異[7]。

目前，BRAF抑制劑對KIAA1549-BRAF基因融合相關的膠質瘤治療效果欠佳。具有KIAA1549-BRAF基因融合的星形細胞瘤細胞系對BRAF抑制劑Vemurafenib(研究類似物PLX4720)具有天生的耐藥性，在PLX4720治療后反而被矛盾地激活，導致腫瘤細胞加速生長[29]。Jain等[30]研究結果顯示PI3K-AKT-mTOR信號級聯是BRAF融合的主要逃避機制，正在進行的臨床試驗也證實聯合應用Trametinib和依維莫司(Everolimus,mTOR抑制劑)可延緩腫瘤生長速度，抑制、延緩腫瘤獲得性耐藥的產生。

4 BRAF基因異常的檢測

BRAFV600E突變的檢測方法包括多種[31-33]。在臨床上應用最廣泛的是免疫組織化學染色法，通過檢測BRAF V600E突變蛋白的表達來間接反映BRAFV600E基因突變情況。檢測成本相對低廉，檢測快速，操作簡便，靈敏度和特異度均較高[31]，但結果的判讀有時依賴于染色的質量，主觀性較強。直接測序法特異度較高，但操作較復雜，耗時長，靈敏度稍差，目前在臨床工作中應用的并不廣泛。實時聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)雖然靈敏度較高，但具有較差的特異度，因為它是通過擴增的突變基因序列來間接識別的[32]。Bisschop等[33]的研究表明Idylla檢測法不僅可以識別BRAFV600E突變，還可以檢測到BRAF其他位點的突變，其檢測過程無須進行DNA分離，適合BRAF基因突變的快速檢測，但其價格昂貴，臨床推廣較為困難。

目前對于KIAA1549-BRAF基因融合的檢測臨床上應用最多的仍然是熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization， FISH)檢測法，檢測與融合伙伴、融合連接、重排片段大小以及融合基因表達均無關，操作方便、可以直觀觀察，但缺點在于不能判斷融合伙伴。檢測BRAF基因融合的FISH探針包括分離探針和融合探針兩種類型，分離探針可以檢測出未知片段融合，略優于融合探針，但仍無法判斷具體的配體基因。RNA測序法是檢測重排最基礎、最直接及最準確的方法，但其主要限制是需要新鮮標本，以及不能檢測到涉及非轉錄區域的重排事件。此外，由于表達的動態范圍廣，組織特異性強，低水平表達的融合基因也難以檢測到。Nano String技術是多重基因定量檢測技術，此技術可直接檢測條形碼探針標記的單個mRNA轉錄子，不需要擴增就可以單獨計數，其特異度及靈敏度較高，而且對于冰凍切片及石蠟切片都有功能，因此，也是BRAF融合檢測的方法選擇之一，但其缺點也是無法檢測未知的融合[34-35]。

5 結語

BRAFV600E突變及KIAA1549-BRAF融合在不同膠質瘤中發生率不同，而且檢測方法簡便，在膠質瘤的診斷、預后及治療等方面發揮重要作用。BRAFV600E突變在GG、PXA及上皮樣膠質母細胞瘤等膠質瘤中的高檢出率可以輔助膠質瘤病理分型，同時對于兒童膠質瘤的預后有一定提示意義。雖然目前BRAF抑制劑在膠質瘤中的應用僅有個案報道，但其為膠質瘤的治療打開一條新的思路。KIAA1549-BRAF基因融合檢測不僅可以用于兒童低級別的膠質瘤的診斷和鑒別診斷，也可用于與之相關機制的深入研究。