牛大力組織培養(yǎng)技術(shù)研究

陸滟靈 林敏 安冰

摘要? ? 本試驗(yàn)通過(guò)組織培養(yǎng)手段，以牛大力種子為材料，對(duì)外植體誘導(dǎo)及無(wú)菌組織培養(yǎng)進(jìn)行了嘗試，以期獲得牛大力外植體誘導(dǎo)、增殖和生根的適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，消毒方式為75%酒精消毒30 s+0.1%氯化汞消毒15 min，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+益培靈0.20 g/L，增殖培養(yǎng)基為改良MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+益培靈0.10 g/L，生根培養(yǎng)基為改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+瓊脂6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+益培靈0.05 g/L，較適宜牛大力組織培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞? ? 牛大力;組織培養(yǎng);外植體

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S567.19? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）11-0069-02? ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Research? on? Tissue? Culture? Technology? of? Millettia? specisoa

LU Yan-ling? ? LIN Min? ? AN Bing *

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming Guangxi 532500）

Abstract? ? In this experiment，tissue culture was carried out with Millettia specisoa Champ. seeds as the material，explant induction and aseptic tissue culture were attempted，in order to obtain the suitable culture medium and culture conditions for explants induction，multiplication and rooting of Millettia specisoa. The results showed that，the disinfection method was 75% alcohol disinfection for 30 s+0.1% HgCl2 disinfection for 15 min，the explant induction medium was improved 1/2 MS+sucrose 15 g/L+AGAR 6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+Yipeiling 0.20 g/L，and the multiplication medium was improved MS+sucrose 30 g/L+AGAR 6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+Yipeiling 0.10 g/L，the rooting medium was improved 1/2 MS+sucrose 15 g/L+AGAR 6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+Yipeiling 0.05 g/L，which was more suitable for Millettia specisoa tissue culture.

Key words? ? Millettia specisoa Champ.;tissue culture;explant

牛大力（Millettia specisoa Champ.），學(xué)名崖豆藤，豆科崖豆藤屬植物[1]。牛大力性味甘、平，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)的功效，藥食兩用，是生產(chǎn)多種中成藥的主原料。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求的增加，牛大力野生資源日趨枯竭，其育苗培養(yǎng)主要通過(guò)播種育苗和扦插育苗的方式[2]，以種子為外植體材料進(jìn)行牛大力組培快繁的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用野生牛大力種子為外植體，開(kāi)展組織培養(yǎng)技術(shù)研究，以期建立組織培養(yǎng)體系，為野生牛大力組培快繁提供參考[3]。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

供試牛大力種源來(lái)自于廣西寧明縣，采收成熟的新鮮野生莢果種子。

試驗(yàn)所用的組培高效抑菌劑——益培靈購(gòu)自上海宇涵生物科技有限公司，是一種新型組織培養(yǎng)專(zhuān)用防污染殺菌劑。益培靈抑菌劑的作用機(jī)理是穿透微生物的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)干擾復(fù)制或斷開(kāi)微生物關(guān)鍵蛋白質(zhì)的鍵而發(fā)揮殺菌作用。

1.2? ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種100粒牛大力種子，數(shù)據(jù)取3次以上平均數(shù)。試驗(yàn)中所用的外植體誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基pH值均為5.5～5.6，在121 ℃高溫下滅菌15 min，冷卻后備用。試驗(yàn)選擇新鮮飽滿(mǎn)的種子作外植體，用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈，滅菌后接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。無(wú)菌體培養(yǎng)條件為光強(qiáng)3 000 lx、溫度25 ℃。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 外植體消毒

試驗(yàn)結(jié)果表明，污染率與消毒處理時(shí)間成反比，灼傷率則與消毒處理時(shí)間成正比。其中，處理A污染率最高，分別是處理D、C、B的3.1、2.3、1.4倍;灼傷率最低，處理B、C、D分別是處理A的1.8、2.6、6.2倍（表2）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，滅菌方式C最為適宜，污染率和灼傷率均在最佳范圍。灼傷率過(guò)高時(shí)，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，甚至抑制種子的萌發(fā)。在實(shí)際操作中，可將15 min滅菌過(guò)程分作2次8 min滅菌，中間用無(wú)菌水清洗數(shù)次，對(duì)滅菌效果影響不大，且對(duì)褐化、灼傷現(xiàn)象有較明顯的抑制作用。

2.2? ? 外植體誘導(dǎo)階段

試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體誘導(dǎo)階段處理B萌芽率為90%，效果最好，分別較處理A、C、D高出12.5%、26.8%和38.5%;4個(gè)處理污染率無(wú)顯著差異，平均污染率為15%（表3）。說(shuō)明在低濃度時(shí)，萌芽率與6-BA+NAA濃度成正比;超過(guò)一定的濃度，萌芽率則隨濃度升高呈下降趨勢(shì)，且濃度過(guò)高時(shí)，牛大力芽苗纖細(xì)、生長(zhǎng)緩慢、出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，并伴隨愈傷組織異常。

2.3? ? 增殖培養(yǎng)階段

由表4可知，在牛大力增殖培養(yǎng)階段，在6-BA+NAA低濃度時(shí)增殖倍數(shù)隨濃度升高呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)，超過(guò)一定濃度則為遞減趨勢(shì)。增殖培養(yǎng)階段處理B增殖倍數(shù)為5.8，有效芽最多，莖軸健壯，復(fù)葉翠綠，為最佳培養(yǎng)基配比。處理D增殖倍數(shù)最低，分別較處理A、B、C低14.3%、27.6%和17.6%。4個(gè)處理的污染率相差不大，平均值為8.2%。

2.4? ? 生根培養(yǎng)階段

試驗(yàn)結(jié)果表明，生根培養(yǎng)階段處理B最優(yōu)，生根率為68%，根系健壯，側(cè)根發(fā)達(dá)，較處理A、C、D生根率分別高出13.3%、15.3%和44.7%;4個(gè)處理污染率差異不大，均在6%左右（表5）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，在牛大力生根階段，在低濃度時(shí)生根率隨IBA+ABT1濃度升高呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)，超過(guò)一定濃度后呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)。

3? ? 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒方式為75%酒精消毒30 s+0.1%氯化汞消毒15 min，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良1/2 MS+蔗糖15 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.15 mg/L+益培靈0.20 g/L，增殖培養(yǎng)基為改良MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.20 mg/L+益培靈0.10 g/L，生根培養(yǎng)基為改良1/2MS+蔗糖15 g/L+瓊脂6 g/L+IBA 1.5 mg/L+ABT 1 1.5 mg/L+益培靈0.05 g/L時(shí)，培養(yǎng)效果較好。新鮮的牛大力種子萌發(fā)率最高，當(dāng)天剝開(kāi)果殼的種子萌動(dòng)快、發(fā)芽率高且污染率低[4]。不同濃度激素對(duì)野生牛大力組培各階段都有顯著影響，均表現(xiàn)為低濃度時(shí)促進(jìn)、超過(guò)一定濃度后抑制。濃度配比適宜時(shí)，苗木健壯，葉片翠綠，生長(zhǎng)迅速，有效芽多;激素濃度過(guò)高，則多發(fā)生畸形、玻璃化等現(xiàn)象，易形成白色松散的愈傷團(tuán);激素濃度過(guò)低，又影響萌動(dòng)，這與相思樹(shù)等其他樹(shù)種的組織培養(yǎng)有相似性[5]。牛大力是木質(zhì)藤本植物，在本試驗(yàn)中，生根率最高僅為68%，這與其他研究結(jié)果類(lèi)似[1，6]。因此，牛大力生根培養(yǎng)適宜的生長(zhǎng)素種類(lèi)及最佳濃度配比，還有待進(jìn)一步的研究。

傳統(tǒng)中藥材牛大力食藥兼用，在藥理研究中，具有保護(hù)和修復(fù)輻射損傷、調(diào)節(jié)免疫功能、護(hù)肝、祛痰、平喘等功能[7-8]。其化學(xué)成分分析顯示，牛大力富含黃酮類(lèi)化合物、多糖及多種微量元素，具有藥源充足、療效顯著、毒副作用較小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。近年來(lái)，牛大力野生資源遭到了極大的破壞，幾近枯竭，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行牛大力快繁具有重要的意義，有待于進(jìn)一步的研究深入，完善技術(shù)體系，在理論和生產(chǎn)上提供技術(shù)參考。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介? ?陸滟靈（1981-），女，廣西寧明人，助理工程師。研究方向：組織培養(yǎng)和森林培育。

通信作者

收稿日期? ?2020-03-04