微塑料（MPs）與全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）復合暴露對普通小球藻的毒性研究

蘇佳偉 俞博浩 張德勇

【摘 要】為分析MPs與PFOS染物復合暴露對普通小球藻的毒性效應，分別設計了兩種物質單獨及復合染毒實驗，以普通小球藻為受試生物，分析增殖速度及各生理指標。單獨染毒實驗證實MPs、PFOS均會抑制藻類的增殖速度，96h-EC50值分別為95.85 mg/L和311.06 mg/L;伴有葉綠素含量、總抗氧化能力、抗氧化酶活力、可溶性蛋白含量的下降;另外蛋白表達異常、MDA含量上升。復合染毒時仍出現上述毒性效應，但各指標的聯合毒性普遍低于單獨染毒的效應之和，即呈現出一定的拮抗效應，但是當染毒物質的劑量提高后，這種拮抗效應有所減弱。

【關鍵詞】微塑料（MPs）;全氟辛烷磺酸鹽（PFOS）;普通小球藻;復合暴露;毒性效應

微塑料（Microplastics，MPs）指尺寸小于5 mm的塑料碎片、顆粒及纖維，因其體積小而易于進入生物體內。人類大量使用塑料已有100多年，據統計僅我國2016年塑料制品總產量就達到了7717萬噸。塑料制品的濫用和排放已致大量MPs進入了環境介質，成了重要的環境污染物。藻類是水生生態系統中的初級生產者，處于食物鏈底端，評價MPs對藻類的影響可以為全面認識其生態危害提供很好的切入點。當前關于MPs的毒性效應及其機制的研究尚不夠系統，針對藻類的研究尤其不足。MPs對藻類的毒性可為可抑制細胞生長、破壞細胞膜結構、降低葉綠素含量和光合效率、引起細胞氧化損傷等，且毒性大小與微塑料本身的種類、大小、濃度等有關[1-3]。

Besseling等研究了納米的聚苯乙烯（PS）對斜生柵藻生長和光合作用的影響，在實驗濃度范圍內，隨納米級PS 濃度增加藻細胞生長抑制率升高，相反，葉綠素a 含量降低[4]。Zhang 等的實驗結果表明96 h暴露實驗后，微米級聚氯乙烯對中肋骨條藻生長抑制率可達39.7%;在高濃度（50 mg/L）暴露實驗中，葉綠素含量和光合效率也明顯下降;而毫米級微塑料聚氯乙烯（MP-PVC）對微藻的生長沒有明顯影響。觀察發現PVC破壞了藻細胞的細胞壁和細胞膜的完整性。PVC暴露實驗初期，藻細胞生長明顯受到抑制、葉綠素含量和光合效率明顯下降;暴露實驗后期，不良影響效應減小，但仍低于空白對照水平在另一研究中，MP-PS明顯抑制特氏杜氏藻生長，并且PS 粒徑越小抑制作用越明顯，但對光合作用卻沒有影響[3]。另外，Bhattacharya等發現MP-PS不僅能降低小球藻和柵藻光合作用效率，而且還增加了藻細胞內活性氧（ROS）的含量。微塑料影響藻細胞生長的同時，藻細胞也會產生應激反應以減小、修復微塑料對其造成的損傷，但當損傷程度超出藻細胞自我修復能力范圍后會導致藻細胞生長異?；蛩劳觥ao等研究聚苯乙烯微塑料（MP-PS）對蛋白核小球藻的毒性，并首次報道了微塑料具有抑制和刺激藻細胞生長的雙重作用[1]。同時，MPs對水中的溞類、貝類等低等動物的毒性效應也被證實，因此可以說MPs對水生生態系統的威脅是全方位的[5-9]。

但當前研究絕大多數采用了MPs單獨染毒方式，其結論遠遠不能反映實際環境中MPs因和其他污染物共同存在可能導致的復合效應。為分析MPs與其他污染物聯合暴露對淡水藻類具有何種效應并初步揭示其產生機制，本研究擬評價不同劑量的MPs與PFOS聯合染毒后，對普通小球藻的增殖、光合作用、抗氧化能力等方面的毒性效應及其與單獨染毒的差異。其中所選擇的PFOS污染物是水體環境中普遍存在的具有代表性的污染物，它具有親脂性、持久性、生物累積性和生物毒性等特點，且被證實對多種生物具有毒性效應[10-13]。本研究的結果有助于更全面地認知MPs與水體中其他污染物聯合暴露對藻類的復雜毒性效應，為相關污染物的治理提供科學依據，并為進一步研究其對高等生物的毒性效應提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻類培養及染毒方案

普通小球藻（Chlorella vulgaris）及淡水綠藻專用培養基購自中科院水生所。微塑料材料為聚乙烯（PE）原料粉末，粒徑為微米級。藻類培養條件為25℃、12h/12h光暗循環。單獨染毒、聯合染毒方案參見結果部分的表格。藻類染毒后繼續培養96h后分析各指標。

1.2 藻類生物量的光密度分析法的建立

首先對藻液進行全波長掃描，找出特征吸收峰。然后分別利用吸光度法與顯微鏡計數法建立藻濃度與吸光度值之間的回歸方程。

1.3 藻類的生長抑制效應分析及96h-EC50值計算

基于A690值繪制生長曲線，建立抑制率P和濃度的自然對數LnC的線性回歸關系，求解抑制率為50%的濃度值即EC50值。抑制率P（%）=（對照組A690-處理組A690）/對照組A690

1.4 抗氧化酶活性測定

1.4.1 SOD活性測定

收集藻細胞，研磨、離心，取上清為SOD粗提液。采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活力，再按照2.35mL Tris-HCl緩沖液、1.8mL蒸餾水、0.15mL鄰苯三酚溶液、200μL樣液的反應體系測定ΔA325。U=[（A325-ΔA325）/ΔA325×100%]/50%×Vs×D/V總。

1.4.2 POD活性測定

藻細胞破壁后，上清充分轉入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反應混合液3ml和酶液1mL。立即開啟秒表記錄A470，每隔1min讀數1次，共5min。U=（A470×0. 01×W ×t）×樣品稀釋倍數。

1.4.3 CAT活性測定

藻細胞破壁后，加入3mL0.05mol/L pH7.8 PBS，再加入200μL 30%H2O2迅速搖勻，1分鐘后開始，每1 min記錄1次A240，連續記錄5min。U=ΔA240×Vt/W/Vs/0.01/t。

1.5葉綠素含量測定

藻液用高速離心法提取，加1.5mL乙醇和少許石英砂研磨，轉入離心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm離心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，測吸光值。葉綠素a濃度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1為提取液定容體積（mL）;V2為濾液體積（L）。

1.6可溶性蛋白含量測定

取藻類破壁離心后的上清于1cm光程石英比色皿中測定A280和A260，按公式計算可溶性蛋白含量。

1.7 藻類MDA活性測定

藻液離心后加10%TCA研磨，勻漿液12000rpm離心10min。取2mL上清于試管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm離心10min，取上清測吸光度。MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.8 統計分析

采用單因素方差分析（One Way ANOVA）分析處理組與對照組之間的差異顯著性，p<0.05為顯著。

2 結果

2.1藻類生物量的光度分析法的建立

經連續波長掃描，普通小球藻在690nm處有吸收峰;然后基于藻密度與A690建立了線性回歸方程：y=0.025x+0.0403;R?=0.9613。二者具有較理想的線性關系，便于快速測定藻類生物量。

2.2單獨及聯合染毒對普通小球藻的增殖速度的影響

如圖1所示，MPs及PFOS單獨染毒對小球藻均有抑制效應，96h-EC50為95.85mg/L。聯合染毒則均呈現為拮抗作用，即MPs+PFOS聯合染毒引起的抑制率小于單獨染毒的抑制率之和（0.405<0.517;0.334<0.508）。

2.3單獨及聯合染毒對普通小球藻抗氧化酶活性的影響

如表1所示，單獨染毒下三種物質對藻類的抗氧化酶活性均有抑制效應。聯合染毒時，MPs+PFOS的抑制值（SOD 9.980、5.703;POD 0.510、0.469;CAT 44、24）小于單獨染毒相加之和。因此MPs與PFOS聯合染毒時均呈現為拮抗作用。

2.4 MPs單獨及聯合染毒對普通小球藻葉綠素含量的影響

如表2所示，染毒物單獨染毒均可導致小球藻葉綠素含量下降。聯合染毒的表現則以輕度的協同效應為主。MPs+PFOS的聯合效應則因劑量不同而出現了一些波動（0.458<0.493;0.409>0.365）。

2.5 單獨及聯合染毒對普通小球藻可溶性蛋白含量的影響

如表2所示，MPs和PFOS的染毒均導致小球藻的可溶性蛋白含量下降。而在聯合染毒實驗中，MPs+PFOS呈現低劑量時表現為協同作用（0.640>0.290），高劑量表現為輕度拮抗（0.715<0.770），這種情況比較復雜，顯示不同污染物之間的作用可能會受各種因素影響，甚至會因劑量的不同出現相反的結果。

2.6 MPs單獨及聯合染毒對普通小球藻MDA含量的影響

如表2所示，各染毒組MDA 含量均高于空白對照組，且隨著染毒濃度的增加而升高，而在低濃度PFOS 下其MDA 含量（0.300）與空白對照組（0.295）相差不大，可見低濃度的PFOS 對藻類MDA含量影響不大。同樣的比較MPs 陰性染毒組與PFOS 陰性染毒組，如M2P0 的MDA 含量為1.179μmol/L，而M0P2 的MDA 含量為0.656μmol/L 可以發現MPs 對藻類MDA 含量的毒性效應更大更顯著。聯合染毒組的MDA 含量升高程度普遍小于所對應的單獨染毒組之和。故可以認為MPs與PFOS 聯合染毒表現了一定的拮抗效應。

3討論

當前MPs已成為引人關注的重要污染物。水中的MPs會被生物誤以為浮游生物而主動對其進行捕食，從而進入生態系統的食物鏈（網）。研究發現許多水生動物的胃、消化管、肌肉等組織和器官中均含有微塑料存在。近來甚至在人體內也普遍檢測到了微塑料的存在，且種類多達數十種。藻類是水生生態系統的生產者，MPs對藻類的影響關系到整個水生生態系統的維系。在本研究中，MPs被證實能抑制普通小球藻的增殖，并引起葉綠素含量、抗氧化能力等的下降等，這一結論與與以往在其他藻類上的研究報道基本一致（雖然以往某些研究稱觀察到同時促進和抑制藻類生長的所謂“雙重效應”，但屬于個例，在本研究所采用的普通小球藻上未觀察到此情況）。同時，與以往研究不同，本研究更側重于考察MPs與其他污染物聯合暴露時呈現的毒性效應。除了葉綠素指標有點例外，在所研究的絕大多數指標中，我們均證實了MPs、PFOS聯合暴露時，會呈現一定的拮抗效應，即聯合毒性低于兩種物質單獨暴露引起的毒性之和。這一現象以往罕有探討，初步分析其原因可能是MPs具有較強的吸附性和漂浮性，導致其他污染物能被吸附在其顆粒上而無法發揮對藻類的毒性。另外，結果也顯示當染毒劑量雙雙升高時，拮抗效應往往有所減弱。

本研究在評估藻類的狀態采用了葉綠素、抗氧化狀態、蛋白表達、可溶性蛋白含量幾個重要指標。葉綠素是光合作用的執行者，測定葉綠素含量可以了解植物物質轉化的程度和速度，其含量高低直接反映藻類的生長繁殖能力。以MPs+PFOS聯合染毒為例，空白對照組葉綠素含量為0.572mg/L，而各染毒組依次為0.367、0.284、0.163、0.131、0.138和0.114mg/L，最低組僅為空白組的19.9%，降低非常明顯。雖然聯合染毒有一定的拮抗效應，但對于緩解這種毒性效應實際意義不大。藻類的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯系，抗氧化酶的活力有助于大致藻類的健康狀況。以MPs+PFOS聯合染毒為例，為了充分評估普通小球藻的抗氧化狀態，分別測定了3種抗氧化酶的活力。其中SOD是負責清除氧自由基的酶，POD藻類體內負責分解過氧化物的酶，CAT是能夠催化過氧化氫分解為水和分子氧，這三者均是藻類抗氧化損傷、清除代謝廢物的關鍵物質，對藻類的生長代謝非常重要[14，15]。以MPs與PFOS對小球藻的SOD活性影響為例，空白組SOD活性為15.946U/g，MPs染毒組的數值分別為7.248U/g、5.315U/g，聯合染毒組中活性最高的為3.383U/g，最低的為0.966U/g，分別為對照組的45.45%、33.33%、21.21%和6.05%?？扇苄缘鞍踪|有助于藻類對抗環境脅迫，還能增加細胞滲透濃度和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝，因此也是反映抗逆狀態的指標。在本研究中，低劑量的MPs對可溶性蛋白產生的毒性效應微小，但POFS結合后則會產生協同作用，大大增強TCS對可溶性蛋白的毒性。MDA是膜脂過氧化作用的最終分解產物，其含量反映藻類遭受逆境傷害的程度。MPs在本研究被證實對藻類的細胞膜能夠造成嚴重危害，并且在MPs與PFOS聯合染毒中對MDA含量存在著協同作用。這進一步增強了染毒物對藻類細胞膜的破壞。

本研究初步證實了MPs對藻類有顯著的毒性效應但同時也能適度減輕水體中存在的其他污染物的毒性。當多種毒物同時作用于藻類時，呈現的效應非常復雜。MPs的毒性機制涉及破壞光合作用、損害抗氧化能力、影響某些蛋白的表達等，但尚有許多問題有待進一步研究，例如在具體哪些蛋白發生了表達異常、微塑料有無引起藻類的DNA損傷等。

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作者簡介：

蘇佳偉，2000年11月出生，男，漢族，浙江嘉興人，本科生，研究方向為生物工程，單位：浙江樹人大學;

俞博浩，2000年6月出生，男，漢族，浙江舟山人，本科生，研究方向為生物工程，單位：浙江樹人大學;

通訊作者：

張德勇，1978年4月出生，男，漢族，山東聊城人，博士生，教授，研究方向為毒理生態學，工作單位：浙江樹人大學。

基金項目：

本研究受浙江樹人大學實驗室開放項目（2021JS3012）資助。

（作者單位：浙江樹人大學生物與環境工程學院）