高效液相色譜法測定納他霉素假陽性結果的原因及其對策分析

李月月 賀亞如 磨家佳

摘 要：分析了高效液相色譜法測定月餅中納他霉素時產生假陽性的原因，并給出了相應的對策建議。市場抽檢的30個月餅樣品中過半出現疑似目標峰，通過加標實驗、改變流動相比例、更換色譜柱及采用二極管陣列檢測器（DAD）光譜分析定性等方法排除假陽性。結果表明，采用DAD的光譜分析法佐以加標實驗可以有效排除假陽性。

關鍵詞：高效液相色譜;納他霉素;DAD;假陽性

納他霉素是一種由多種鏈霉菌發酵產生的天然抗真菌化合物，屬于多烯大環內酯類[1]，可以廣泛有效的抑制各種霉菌的生長，延長食品的保質期而不影響其口味和外觀[2]，在食品工業中有一定的應用價值[3]。納他霉素雖然是國家允許使用的防腐劑，但過量食用，納他霉素可中和抗體，損害身體健康[4]。

國家標準GB/T 21915-2008中規定可用高效液相色譜（配紫外檢測器）法來測定食品中的納他霉素，但對于一些復雜樣品如糕點，基質復雜，前處理難以消除部分基質的干擾，容易出現假陽性的現象[5]，直接影響結果的準確性，因此如何排除假陽性顯得非常關鍵。

1 實驗過程

1.1 試劑

納他霉素標準品（純度為99.0%）;納他霉素標準儲備液（準確稱取0.005 0 g納他霉素標準品，用甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標準儲備液）;甲醇（色譜純）;乙腈（色譜純）;冰乙酸（優級純）。

1.2 儀器

天平（0.000 1 g，梅特勒）;高效液相色譜儀—配紫外檢測器（島津LC-2030C）;高效液相色譜儀—配二極管陣列檢測器（賽默飛UltiMate3000）。

1.3 實驗步驟

準確稱取5.00 g月餅皮，置于離心管中，加入30 mL甲醇提取30 min，加水10 mL，搖勻后置于離心機中以3 500 r/min離心5 min，取上清液過膜后上機測定。

2 結果與討論

本次實驗中的30個月餅樣品中過半出現了目標峰，因此首先考慮假陽性問題。實驗過程中出現假陽性的原因有很多：樣品受到了污染、樣品基質復雜或存在其他干擾組分。根據以上原因分析，需要對假陽性峰進行逐一篩除。色譜中確認和排除假陽性峰的方法有：加標確認、改變色譜條件、方法比對、質譜確認等。

2.1 樣品受到污染

在實驗前處理過程中，如果樣品受到污染，結果會出現假陽性。處理方法是按照同樣的方法，對樣品進行重新取樣、制樣、稱樣，使用清潔的容器重新進行前處理操作，并同時做空白試驗。結果顯示空白樣品中未發現目標峰，而重新處理后的樣品目標峰仍然存在，這樣就排除了樣品在前處理中代入污染物和容器被污染的可能性。

2.2 樣品中存在干擾物

當樣品中存在干擾物時，首先考慮對該樣品進行加標。選取一個出現疑似目標峰的樣品793（圖1a）進行加標，檢測結果如圖1b所示，加標樣品中的納他霉素峰與疑似目標峰完全重合在一起。

為分離793加標樣品中加標峰和干擾峰，首先考慮調整流動相，將甲醇變為乙腈，并改變流動相比例，隨著有機相的減少，出峰時間推后，目標峰出現分離，但沒有完全分離。然后更換色譜柱，出峰時間推遲，但仍然與標準品保留時間一致，無法判斷是否為假陽性。

2.3 儀器原因

2.3.1 紫外檢測器

納他霉素的檢測一般使用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀，從保留時間來判斷目標峰是否為納他霉素。但是對于復雜基質樣品，現有前處理手段無法排除所有干擾，假陽性問題無法徹底排除。圖2為納他霉素標準品（圖2a）與樣品793（圖2b）的色譜圖，從圖中可以看出，樣品793的目標峰與標準品中的納他霉素峰保留時間十分接近，可以判定為陽性樣品。但是由于過半樣品檢測出相似的目標峰，因此，首先考慮假陽性問題。

2.3.2 二極管陣列檢測器

二極管陣列檢測器（DAD）不僅可檢測純度，也可隨色譜峰的流出自動采集峰頂光譜圖，與計算機譜庫貯存的標準光譜圖進行對比檢索[6]，大大提高了定性的可信度。

從圖3可以看出樣品793目標峰的光譜圖（圖3b）與納他霉素標品（圖3a）的光譜圖的最大吸收波長與峰型走勢都不同，而加標樣品的納他霉素峰（圖3c）與納他霉素標品的光譜圖基本一致，因此可以判定樣品793為假陽性。

3 結論

液相色譜法定性需要謹慎，保留時間接近或一致也可能不是同一種物質，當出現可疑數據時，應經過多方驗證加以排除。實驗表明，DAD光譜分析法佐以加標實驗，可以有效排除糕點中納他霉素檢測的假陽性問題，此法簡單快速，適用于大部分假陽性問題的判斷，是解決假陽性問題的理想方法。

參考文獻

[1]WANG S H， LIU F， HOU Z W， et aL. Enhancement of natamycin production on streptomyces gilvosporeus by chromosomaL integation of the vitreosciLLa hemogLobin gene（vgh）[J].Word J MicrobioL BiotechnoL， 2014，30（4）：1369-1376.

[2]DONG X H， GAO W J， HE X P. AntifungaL efficacy of natamycin in experimentaL fusarium soLani keratitis[J].Int J OphthaLmoL，2012，5（2）：143-146.

[3]徐寶興，王艷芬，孫冬梅，等.納他霉素的特性及研究進展[J].安徽農業科學，2014，42（22）：7426-7428.

[4]Repizo， L.M.， Martinez， L.D.， OLsina， R.A. et aL. A noveL and rapid method for determination of natamycin in wines based on ultrahigh-performance Liquid chromatography coupLed to tandem mass spectrometry：vaLidation according to the 2002/657/EC European decision[J].AnaL BioanaL Chem，2012，402：965-973.

[5]莫紫梅.高效液相色譜法測定糕點中納他霉素的含量[J].糧食與飼料工業，2016，8（16）：66-68.

[6]丁濤，徐錦忠，李建忠，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測及電噴霧串聯質譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J].色譜，2008，6（1）：6-9.