補腎抗衰片對動脈粥樣硬化模型血管周圍脂肪炎癥的實驗研究*

王銘揚，仲愛芹，熊 鑫，許曉敏，李艷陽，辛 穎，張 寧，謝盈彧，王愛迪，田立俊，張軍平，王清泉

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

血管周圍脂肪組織（PVAT）指僅附著于血管外膜層的脂肪組織，主要由脂肪細胞、成纖維細胞、肥大細胞以及神經細胞等構成，圍繞著除腦血管外的全身各處血管（大到主動脈，小到真皮層微血管），尤其是冠狀動脈和主動脈[1]。目前研究認為，PVAT是一種在形態和功能上均不同于皮下脂肪及內臟脂肪的新的脂肪組織，除了具有保護性生理功能外，也有病理性特性[2]。在病理狀態下，通過改變自身的內分泌、旁分泌功能，改變血管壁的結構和功能，參與如動脈粥樣硬化（AS）的發生[3-4]。在AS發生發展過程中，血管壁的炎癥反應是主要機制之一[5]，而PVAT與血管外膜之間不存在解剖學屏障，可以分泌多種介質（脂肪因子和細胞因子）參與血管壁的炎性反應。其中脂肪因子如瘦素、脂聯素等，細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-10、基質金屬蛋白酶（MMPS）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血漿纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）等[6]，這些因子通過直接浸潤的旁分泌途徑，直接進入動脈內，或通過滋養血管分泌途徑“由外到內”作用于動脈管壁的各層細胞（外膜成纖維細胞、中膜平滑肌細胞、內膜內皮細胞），調節他們的生長、凋亡、基質蛋白分泌、功能狀態及其他表型，參與AS的發生發展[7-9]。對其深入研究，可能為AS相關性疾病的治療提供新靶點。補腎抗衰片臨床應用30余年來，治療AS相關性疾病療效確切[10-11]，團隊前期動物實驗結果表明，其具有較好抗AS效果[12-14]，但作用機制尚未完全明確。因此，本研究建立AS模型，以補腎抗衰片為干預藥物，觀察其對PVAT組織的影響，進而檢測相關炎癥因子的表達，探討其是否對PVAT炎癥的表達具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 補腎抗衰片（組成：丹參、夏枯草、何首烏、茯苓、黨參、菟絲子、桑寄生等），每片0.5 g，天津中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑。阿托伐他汀鈣片，每片10 mg，輝瑞制藥有限公司生產，批號：國藥準字H20051407。

1.2 試劑 Anti-TNF-α抗體（MR0604，UCallM 公司）；Anti-Leptin抗體（ab16227，Abcam 公司）；Anti-MMP-9抗體 （MAB3309，Merck公司）；Goat anti Mouse IgG（H+L）-HRP（SA-2011H，UCallM 公司）；Goat anti Rabbit IgG （H+L）-HRP（SA-2021H，UCallM公司）；DAB顯色試劑盒（AR1022，博士德生物工程有限公司）。

1.3 模型制備及分組給藥 清潔級健康雄性新西蘭兔 24 只，體質量（2.2±0.2）kg，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物許可證號：SCXK京2010-0002）。將其隨機分為對照組、模型組、補腎抗衰組、阿托伐他汀組。采用高脂飼養法復制AS模型，對照組給予普通飼料，其余各組持續予高脂飼料（1.5%膽固醇+5%豬油+9%蛋黃粉+0.2%膽酸+84.3%普通飼料，購于北京科奧協力飼料有限公司）喂養同時，兩給藥組于4周后分別給予補腎抗衰片1.0 g/（kg·d）（片劑質量）、阿托伐他汀鈣片5 mg/（kg·d）（片劑質量）[15]，連續干預8周。

1.4 取材及病理形態學檢測 末次給藥后，禁食12 h（正常飲水），各組動物麻醉、固定，心臟灌注后取附著PVAT的胸主動脈，石蠟包埋、切片后行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察主動脈病理形態學變化，采用Image-pro plus圖像分析軟件分析，每個目標血管各取6張切片，每張切片取1個血管環均測量2次取平均值，最后計算6個血管環所得的數據均值作為該標本的最終數值。計算參數如下：1）內膜增生面積=內彈力層圍繞面積（IELA）-血管環管腔橫截面積（LA）；2）中膜面積=外彈力層圍繞面積（EELA）-IELA；3）內中膜比值（IMR）=內膜增生面積/中膜面積，反映內膜增生程度。

觀察PVAT脂肪細胞的形態學變化，用Imagepro plus圖像軟件分析系統測量脂肪細胞的大小（直徑）。每張切片在10×40倍鏡下，隨機取3個視野，測量該視野內全部完整脂肪細胞直徑，計算平均值作為最終數值。

1.5 免疫組織化學染色法檢測 主動脈及血管外周脂肪組織TNF-α、瘦素、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達石蠟切片脫蠟至蒸餾水，滅活內源性過氧化物酶，抗原微波修復，5%BSA封閉液封閉30 min，不洗，滴加Ⅰ抗（抗體稀釋比例分別為：TNF-α 1∶50、Leptin 1∶500、MMP-9 1∶500），4 ℃孵育過夜，復溫，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗5次，每次5 min，滴加Ⅱ抗，孵育 30 min，孵育SABC30min，DAB 顯色 5～10min，蘇木精復染，脫水、透明后封片。光鏡下觀察，陽性表達為出現黃褐色顆粒，隨機選取5個互不重疊的視野，用Image-Pro Plus軟件，測量胸主動脈內膜陽性染色面積占內膜面積百分數及PVAT組織陽性染色面積。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 觀察各組動物的一般情況（皮毛、精神狀態、反應、飲食、糞便等），稱量體質量變化，剔除進食不佳、狀態不好及血脂不穩定者。

2.2 補腎抗衰片對AS模型兔主動脈內膜病理學的影響 見圖1。對照組主動脈內膜層薄、完整、連續，內皮細胞排列整齊，沒有斑塊。模型組內膜明顯增厚，不連續甚至缺失，大量泡沫細胞堆積在整個管腔內部，向管腔內凸起，大量平滑肌細胞移行至內膜下或可見泡沫細胞及脂質沉積于內膜下形成脂質核心。與模型組比較，阿托伐他汀組和補腎抗衰片組中內膜增生程度均不同程度的下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表 1。

圖1 AS模型主動脈病理形態學改變（HE染色×100）Fig.1 Pathological of aorta in AS model(HE staining×100)

表1 各組動物主動脈內/中膜面積比（±s）Tab.1 Ratio of aortic neointima to media area in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數 I M R對照組 6 0.0 7±0.0 2模型組 6 1.8 2±0.1 2*阿托伐他汀組 6 0.9 4±0.0 9##補腎抗衰片組 6 1.5 2±0.2 3#

2.3 補腎抗衰片對AS模型兔PVAT脂肪細胞病理形態學的影響 見圖1。對照組PVAT由大量群集的單泡脂肪細胞構成，呈蜂窩狀結構，空泡狀排列規則，細胞質、細胞核位于細胞一側。脂肪細胞直徑從小到大依次是：對照組、阿托伐他汀組、補腎抗衰片組、模型組。與對照組比較，模型組脂肪細胞直徑增大，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，兩給藥組細胞直徑均有不同程度的減小，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4 補腎抗衰片對AS模型主動脈及血管外周脂肪組織炎癥的影響

2.4.1 TNF-α免疫組化染色結果 對照組主動脈內未見黃褐色顆粒表達，模型組增生的內膜中可見大量深褐色顆粒表達；與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達面積均不同程度的減小，差異有統計學意義（均為 P＜0.05），見圖 2、表 3。

表2 各組動物PVAT脂肪細胞直徑（±s）Tab.2 PVAT fat cell diameter in each group（±s） μm

表2 各組動物PVAT脂肪細胞直徑（±s）Tab.2 PVAT fat cell diameter in each group（±s） μm

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別 動物數 直徑對照組 6 258.75±86.28模型組 6 380.00±63.36*阿托伐他汀組 6 295.50±88.90補腎抗衰片組 6 311.25±62.11

圖2 各組動物主動脈TNF-α免疫組化染色結果（×100）Fig.2 Immunohistochemical staining results of TNF-α in aorta of each group(×100)

表3 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織TNF-α蛋白表達情況（±s）Tab.3 Expression of TNF-α protein in the aorta and PVAT of each group（±s）

表3 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織TNF-α蛋白表達情況（±s）Tab.3 Expression of TNF-α protein in the aorta and PVAT of each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補腎抗衰片組 6面積比百分數（%）0.0 0±0.0 0 3 4.5 8±5.5 6 2 0.7 6±5.4 1#2 1.9 6±6.2 8#面積1 7 0 3 2± 6 5 8 9.4 8 4 8 4 3 5±1 0 2 7 3.3 2*2 7 3 2 2±1 0 3 5 5.8 7#3 0 9 7 0± 8 0 5 4.1 3#

對照組PVAT脂肪細胞膜可見少量黃褐色顆粒表達。與對照組比較，模型組可見大量深褐色顆粒表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達面積均有不同程度的減小，差異有統計學意義（均為 P＜0.05），見圖 3、表 3。

圖3 各組動物血管周圍脂肪組織TNF-α免疫組化染色結果（×100）Fig.3 Immunohistochemical staining results of TNF-α in PVAT tissues of each group(×100)

2.4.2 瘦素免疫組化染色結果 對照組主動脈內膜可見少量黃色顆粒表達。與對照組比較，模型組內膜可見大量深褐色顆粒表達，融合成片，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達面積均有不同程度的減小，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），見圖 4、表 4。

圖4 各組動物主動脈瘦素免疫組化染色結果（×100）Fig.4 Immunohistochemical staining results of leptin in aorta of each group(×100)

表4 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織瘦素蛋白表達情況（±s）Tab.4 Expression of aorticand PVAT leptin protein in each group（±s）

表4 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織瘦素蛋白表達情況（±s）Tab.4 Expression of aorticand PVAT leptin protein in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補腎抗衰片組 6面積比百分數（%）8.1 4±1.5 4 5 4.7 9±2.3 5*1 7.7 5±2.1 5##3 7.5 0±1.0 2#面積2 5 7 4.0 0±1 5 1 1.3 0 4 9 5 4 2.3 3±2 0 3 7.4 7*2 1 5 7 4.3 3±4 2 6 0.9 5##2 4 9 5 9.3 3±2 3 8 6.9 2##

對照組PVAT脂肪細胞膜可見少量黃色顆粒表達。與對照組比較，模型組PVAT脂肪細胞膜可見大量深褐色顆粒，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達面積均有不同程度的減小，差異有統計學意義（均為P＜0.01）。見圖5、表 4。

圖5 各組動物血管周圍脂肪組織瘦素免疫組化染色結果（×100）Fig.5 Immunohistochemical staining results of leptin in PVAT of each group(×100)

2.4.3 MMP-9免疫組化染色結果 對照組主動脈內膜未見明顯褐色顆粒。與對照組比較，模型組增生的內膜中可見大量陽性表達，呈深褐色，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥陽性顆粒表達面積均有不同程度減小，差異有統計學意義（為 P＜0.05），見圖 6、表 5。

圖6 各組動物主動脈MMP-9免疫組化染色結果（×100）Fig.6 Results of MMP-9 immunohistochemical staining of aorta in each group(×100)

表5 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白表達情況（±s）Tab.5 Expression of MMP-9 protextaand PVAT of each group（±s）

表5 各組動物主動脈、血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白表達情況（±s）Tab.5 Expression of MMP-9 protextaand PVAT of each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數對照組 6模型組 6阿托伐他汀組 6補腎抗衰片組 6面積比百分數（%）6.0 7±1.3 3 4 5.4 9±1 1.8 9*2 5.3 0±6.6 5#2 7.7 2±7.0 7#面積2 2 6 4 9.6 7±3 8 4 5.2 6 4 2 4 3 6.0 0±5 2 0 7.2 9*3 2 6 5 5.0 0±3 5 7 1.9 1#3 3 6 6 3.0 0±4 1 0 4.8 4#

對照組PVAT脂肪細胞膜可見少量黃色顆粒表達。與對照組比較，模型組PVAT脂肪細胞膜可見大量深褐色顆粒表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組陽性顆粒表達面積均有不同程度減小，差異有統計學意義（P＜0.05）,見圖 7、表5。

圖7 各組動物血管周圍脂肪組織MMP-9蛋白免疫組化染色（×100）Fig.7 Immunohistochemical staining of MMP-9 protein in PVAT tissues of each group(×100)

3 討論

血管周圍脂肪組織一直被認為是保護和支撐血管的一類脂肪組織。近年來，越來越多的實驗研究證實，PVAT是一層貼近血管外膜層的脂肪組織，對AS的形成起雙向作用。在生理條件下，PVAT具有抗炎、維持血管穩態，抑制AS發生[16]；病理狀態下，PVAT功能障礙，脂肪細胞數量增多、體積增大，功能失調，細胞成分和分子特性改變，釋放大量的促炎性因子（如抵抗素、瘦素）、細胞因子（如TNF-α、IL-6） 和 趨 化 因 子 （RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2），而抗炎性脂肪因子（如脂聯素）產生減少[17]。本研究觀察了AS模型主動脈及PVAT脂肪細胞病理形態學的變化，結果表明，補腎抗衰片可以改善AS模型PVAT巨噬細胞浸潤情況，并在一定程度上減少脂肪細胞直徑，提示其具有抑制PVAT炎癥狀態的作用，故后續實驗進一步研究其對相關炎癥因子（TNF-α、瘦素、MMP-9）表達的影響。

TNF-α和瘦素是PVAT分泌的炎性脂肪因子。當炎癥發生時，巨噬細胞和脂肪細胞分泌大量炎性脂肪因子，而炎性脂肪因子又能夠反過來加劇PVAT組織和血管炎癥，使得PVAT組織和血管炎癥越來越嚴重[18]。MMP-9是一種主要表達于巨噬細胞的蛋白酶，正常情況下表達量極少。在AS中，主要通過降解細胞外基質（ECM），增加血管內皮通透性，使脂質、炎癥細胞等更易進入血管壁，刺激平滑肌細胞（VSMC）增殖和遷移，VSMC產生和分泌大量ECM，形成纖維帽；隨著AS發展，MMP-9的表達明顯增加，降解大量ECM，并影響VSMC凋亡，使斑塊不穩定及破裂[19]。本研究觀察了AS模型主動脈及血管周圍脂肪組織瘦素、TNF-α、MMP-9的表達，結果表明，補腎抗衰片可以通過抑制TNF-α、瘦素、MMP-9的表達，對AS模型血管周圍脂肪炎癥起到抑制作用。