黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌CTGF及FN1表達的影響*

尹 超，王朋宇，胡艷云，馬朝朋，王曉妍

（保定市第一中心醫院內分泌三科，保定 071000）

糖尿病性心肌病是發生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病[1]。其在代謝紊亂及微血管病變之基礎上引起心肌廣泛灶性壞死，出現心功能異常，最終進展為心力衰竭及心源性休克，甚至猝死[2]。充血性心力衰竭為糖尿病心肌病的主要臨床表現[3]。由于心肌灶性壞死、纖維瘢痕形成，引起心肌電生理特性不均一而導致心律失常[4]。在糖尿病患者中，女性并發充血性心力衰竭的概率約為男性的2倍。黃連地黃湯組成為黃連（去須）、生地、天花粉、五味子（去梗）、川當歸、人參（去蘆）、干葛、白茯苓（去皮）、麥門冬（去心）、甘草，功效為滋陰清熱，生津止渴，治陰虛火旺之消渴。現代常用于糖尿病性心肌病屬陰虛火旺證者[5]。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠80只，雌性，體質量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.2 受試藥物及試劑 檸檬酸，購于天津大茂化學試劑廠，批號：20171024。檸檬酸三鈉，購于天津大茂化學試劑廠，批號：20170706。。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司，批號：170325。水合氯醛：購于天津大茂化學試劑廠，批號：20161219。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，批號：20171221。總膽固醇（TC）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，批號：20171203。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，批號：20171117。丙二醛（MDA）測試盒，購于南京建成生物工程研究所，批號：20171215。葡萄糖，購于天津市永大化學試劑有限公司，批號：20170213。結締組織生長因子抗體（CTGF），購于北京博奧森生物技術有限公司，批號：20171228。纖維連接蛋白抗體（FN1），購于北京博奧森生物技術有限公司，批號：20171115。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：20170421。鹽酸苯那普利片，購于北京諾華制藥有限公司生產，批號：20170716。TMS-P超敏試劑盒，購于福建邁新生物技術開發有限公司，批號：12/2017。磷酸緩沖鹽溶液（PBS），購于北京Solarbio科技有限公司，批號：20171005。無水乙醇，購于天津市永大化學試劑有限公司，批號：20170910。

黃連地黃湯人用法用量為黃連（去須）、生地、天花粉、五味子（去梗）、川當歸、人參（去蘆）、干葛、白茯苓（去皮）、麥門冬（去心）、甘草各 3 g，用水600 mL煎，去渣溫服，每日2次。本研究所需藥物濃度分別為生藥 0.27、0.54、1.08 g/mL，取以上藥物各45.36g，共計 453.6g，分 2 次煎煮，合計加水 9072mL，合并2次煎液，濃縮至420 mL，制成濃度為生藥1.08 g/mL的濃縮液，每周制備1次，分為7等份密封冷藏保存，灌胃時用蒸餾水等倍稀釋為生藥0.54 g/mL 和生藥 0.27 g/mL。

1.3 儀器 金華科迪KD-P生物組織攤片機。安穩+型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司。金華科迪KD-202型病理切片機。金華科迪KD-H生物組織烤片機。BX53型奧林巴斯顯微鏡。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組、造模、給藥 80只雌性SPF級SD大鼠，隨機選取10只為空白對照組，其余大鼠隨機分為模型組、黃連地黃湯低劑量組（2.7 g/kg生藥）、黃連地黃湯中劑量組（5.4 g/kg生藥）、黃連地黃湯高劑量組（10.8 g/kg生藥）、二甲雙胍合并苯那普利對照組（90 mg/kg，0.9 mg/kg），每組 14 只。先用高脂高糖飼料（普通飼料66.5%、豬油10%、蔗糖15%、蛋黃7%、膽酸鈉0.5%、膽固醇1%）喂養6周，然后大鼠禁食12 h，除空白對照組外其余大鼠腹腔注射濃度為44 mg/kg的STZ，STZ使用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.0）配置[6]。注射 STZ 的第 3 天，測大鼠空腹血糖，血糖大于11.1 mmol/L認為2型糖尿病模型成功，剔除血糖不合格大鼠，各給藥組灌胃體積為10 mL/kg，空白對照組及模型組灌胃等體積的蒸餾水，血糖符合標準的大鼠繼續喂飼高脂高糖飼料，邊造模邊給藥12周，末次給藥后測大鼠空腹血糖。實驗結束時大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，檢測血清 LDL-C、TC、SOD、MDA，最后取心臟用福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化檢測心肌CTGF及FN1表達。

1.4.2 心肌組織HE染色 切片脫蠟至水，常規HE染色。中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察心肌細胞損傷程度。

1.4.3 免疫組化法測定心肌細胞CTGF及FN1表達 切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育5 min。蒸餾水沖洗，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清。滴加Ⅰ抗（CTGF 1∶300；FN1 1∶400），于 37 ℃孵育 2 h。PBS 緩沖液沖洗3次，每次3 min。滴加適量生物素標記的Ⅱ抗，于37℃孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。滴加適量的辣根酶標記的鏈霉素工作液，于37℃孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化圖片采用ImageJ軟件進行灰度值分析[7]。

1.5 統計學方法 所有數據采用SPSS 22.0軟件進行統計處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠模型血糖及血脂的影響 見表1。與空白對照組相比模型組空腹血糖值顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對照組空腹血糖值顯著降低（P＜0.01）。與空白對照組相比，模型組治療后LDL-C顯著升高（P＜0.01），與模型組相比黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對照組治療后LDL-C顯著降低（P＜0.05）。與空白對照組相比模型組血清TC顯著升高（P＜0.01），與模型組相比黃連地黃湯高劑量組、二甲雙胍合并苯那普利對照組治療后血清TC顯著降低（P＜0.05）。

表1 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on fasting blood glucose，LDL-C and TC contents in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

表1 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on fasting blood glucose，LDL-C and TC contents in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數 劑量 治療后空腹血糖值 LDL-C TC空白對照組 10 — 5.45±1.09 0.42±0.07 1.38±0.21模型組 14 — 20.31±4.82* 0.78±0.05* 2.15±0.43*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg生藥 17.59±3.57 0.63±0.06# 2.02±0.34黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg生藥 15.75±3.84# 0.59±0.05# 1.87±0.32黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg生藥 14.33±3.61# 0.55±0.07# 1.71±0.27#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg 11.92±2.52## 0.51±0.05# 1.62±0.29#苯那普利對照組 0.9 mg/kg

2.2 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠模型抗氧化能力的影響 見表2。與空白對照組相比，模型組MDA 顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對照組MDA顯著降低（P＜0.05）。與空白對照組相比，模型組SOD 顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對照組血清SOD顯著增加（P＜0.05）。

表2 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠MDA和SOD的影響（±s）Tab.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on MDA and SOD in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

表2 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠MDA和SOD的影響（±s）Tab.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on MDA and SOD in diabetic cardiomyopathy rats（±s） mmol/L

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 劑量 MDA SOD空白對照組 10 — 3.26±0.49 274.53±35.23模型組 14 — 8.21±2.27* 147.54±19.63*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg 生藥 7.38±1.93 167.28±20.75黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg 生藥 6.44±1.86 175.85±17.74#黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg 生藥 5.73±1.74# 189.53±18.65#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg， 5.17±1.49# 221.57±23.41#苯那普利對照組 0.9 mg/kg

2.3 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠模型心肌損傷的影響 見圖1。空白對照組大鼠心肌細胞無病變；模型對照組大鼠部分心肌細胞溶解消失，且呈現單核細胞浸潤；各治療組大鼠心肌均出現局灶性損傷及單核細胞浸潤，但其損傷程度較模型組有所減輕。

2.4 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠模型心肌細胞CTGF及FN1表達的影響 見表3，圖2、3。與空白對照組相比，模型組心肌細胞CTGF表達顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對照組心肌細胞CTGF表達顯著降低（P＜0.05）。與空白對照組相比，模型組心肌細胞FN1表達顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，黃連地黃湯低劑量組、黃連地黃湯中劑量組、黃連地黃湯高劑量組和二甲雙胍合并苯那普利對照組心肌細胞 FN1 表達顯著增加（P＜0.05）。

圖1 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷的影響Fig.1 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on myocardial damage in diabetic cardiomyopathy rats

表3 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌細胞CTGF及 FN1 表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF and FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（±s）

表3 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌細胞CTGF及 FN1 表達的影響（±s）Tab.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF and FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 劑量 CTGF灰度值 FN1灰度值空白對照組 10 — 158.72±17.34 114.45±16.72模型組 14 — 73.27±9.48* 169.32±19.65*黃連地黃湯低劑量組 14 2.7 g/kg生藥 98.37±12.62#143.87±19.29#黃連地黃湯中劑量組 14 5.4 g/kg 生藥 109.69±15.53#132.64±17.59#黃連地黃湯高劑量組 14 10.8 g/kg生藥 123.78±16.83#129.47±18.16#二甲雙胍合并 14 90.0 mg/kg，苯那普利對照組 0.9 mg/kg 126.48±17.51#126.84±14.39#

3 討論

圖2 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌細胞CTGF表達的影響（×200）Fig.2 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on CTGF expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（×200）

圖3 黃連地黃湯對糖尿病性心肌病大鼠心肌病大鼠心肌細胞FN1表達的影響（×200）Fig.3 Effect of Huanglian Dihuang Decoction on FN1 expression in cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats（×200）

糖尿病性心肌病是指發生于糖尿病患者，在代謝紊亂及微血管病變之基礎上引發心肌廣泛灶性壞死，出現亞臨床的心功能異常，最終進展為心力衰竭，重癥患者甚至猝死[8]。心肌細胞代謝紊亂糖尿病患者的收縮蛋白發生糖基化，導致其功能異常。心肌細胞鈣轉運缺陷隨著心肌細胞外葡萄糖水平的升高直接導致細胞內鈣離子濃度的改變，2型糖尿病的心肌細胞鈉鈣交換受到抑制，鈣離子（Ca2+）濃聚于肌漿網，Ca2+超負荷的心肌肌漿網，心肌舒張時張力增高，心臟的順應性下降[9]。糖尿病患者心肌存在彌漫性心肌壁內小血管病變。糖尿病病程較久由糖基化的膠原沉積引起心肌間質纖維化[10]。糖尿病患者血脂增高能促進血管壁細胞對脂質的攝取，極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）轉變為膽固醇酯，LDL-C糖化損害肝細胞上的相關受體對其識別從而使LDL-C代謝減慢[11]。LDL-C與另外受體結合被巨噬細胞優先吞噬和降解，堆積在巨噬細胞內成為泡沫細胞進而促進動脈粥樣硬化（AS）斑塊的形成[12]。糖尿病患者在血糖控制不良時，三酰甘油含量增加，氧化脂蛋白酶活性增高，LDL-C增加，均成為血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的胞質毒性因素。糖尿病心肌病為與代謝相關的廣泛性心肌損害，心肌細胞肥大、變性、灶性壞死、壞死區為纖維組織取代。針對糖尿病性心肌病目前無特效的治療方法，雖然尚不明確血糖控制是否改變糖尿病性心肌病的病程，仍應及時控制高血糖[13]。治療高血壓是本病的基本治療措施。研究表明中度肥胖的糖尿病患者左室舒張期明顯僵硬，糖尿病患者較正常人群患高脂血癥的概率高，因此需進行降血脂治療[14]。黃連地黃湯對血糖血脂血壓均有影響，黃連煎劑和小檗堿還有降低血糖的作用，黃連水浸液可使血清膽固醇含量降低。當歸流浸膏有抗心律不齊和降壓作用[15]。當歸能抗心肌缺血缺氧。葛根素可抗高血壓，防治AS，葛根素可明顯限制犬實驗性急性心肌梗死范圍[16]。本研究結果表明黃連地黃湯可顯著降低糖尿病性心肌病模型大鼠空腹血糖值、LDL-C及TC含量，同時提高糖尿病性心肌病模型大鼠抗氧化能力。

CTGF對成纖維細胞具有趨化及促有絲分裂作用，CTGF與包括心臟、腎臟及肝臟等在內的許多組織器官纖維化發生發展密切相關[17]。CTGF因具有明顯的趨化性，能誘導成纖維細胞增殖。外源性CTGF可刺激大鼠肝星狀細胞（HSC）增殖及黏附。CTGF在肝纖維化發生發展中起著重要的作用[18]。FN是一種纖維連接蛋白，參與細胞黏附、分化、傷口愈合、凝血和機體防衛。主要分布于結締組織和大部分基底膜上，纖維連接蛋白有促進巨噬細胞的吞噬功能，促進細胞與纖維基質間連接的生理作用[19]。纖連蛋白與機體創傷修復有密切關系。纖維連接蛋白可用于治療血液系統和心腦血管系統疾病。隨著血管硬化程度的增加FN1含量呈下降趨勢。血漿FN1缺乏會引起微血管完整性的破壞和通透性升高，導致血漿大量外滲，血液濃縮，黏度增高，有效循環血量減少，血漿與組織液內平衡失調，引起機體休克等危險情況[20]。糖尿病患者的成纖維細胞外基質蛋白的合成發生改變，FN1與膠原的比例降低，即膠原相對含量升高[21]。在糖尿病和下肢靜脈潰瘍中，FN1含量明顯降低。本研究結果表明黃連地黃湯可顯著降低糖尿病性心肌病模型大鼠心肌細胞結締組織生長因子的表達，顯著增加心肌細胞細胞黏附蛋白的表達，具有明顯的抗心肌損害及心肌細胞纖維化的作用。

綜上所述，黃連地黃湯可通過降低糖尿病性心肌病模型大鼠空腹血糖值、LDL-C、TC含量及心肌細胞CTGF的表達，增加其抗氧化能力及心肌細胞FN1的表達，最終產生抗心肌細胞損害及纖維化的作用。