延胡索葉不同發育期總生物堿含量測定

趙永欽，成余勤，岑巧夢，邵敬寶，馬美蘭，石森林*

(1.浙江中醫藥大學 藥學院，浙江 杭州 310053； 2.東陽市農業技術研究所，浙江 東陽 322100)

延胡索為罌粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥塊莖。在傳統醫學中有兩千多年的應用歷史，主要用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝氣痛、痛經、閉經、產后瘀滯腹痛、跌打損傷等治療[1]，為中藥復方制劑中的常用藥。延胡索原主產于浙江，引種至陜西漢中至今約有40年歷史，到目前已發展成為延胡索主產區之一[2]。研究表明，延胡索地上部分的藥效成分和地下莖的差別很大，主要為阿樸啡型生物堿，如O-甲基南天竹堿、海罌粟堿、1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲、去甲海罌粟堿和β-谷甾醇[3]。O-甲基南天竹堿具有抑制中樞神經[4]、止咳平喘[5]、麻痹[6]的作用；海罌粟堿及去甲海罌粟堿具有抗炎鎮痛[7-9]、擴張支氣管[10]、抗腎上腺素[11]、阻斷鈣離子通道活性[12]的作用；β-谷甾醇具有降膽固醇[13-14]、抑制腫瘤[15-16]和修復胃粘膜[17]的作用；1-甲基乙基-3，4，6，7-四甲氧基菲其具體藥理作用研究較少。目前針對延胡索塊莖生物堿指紋圖譜、提取純化工藝以及藥理活性研究文獻報道較多[18-21]，關于葉總生物堿的研究只有零星報道[22]。延胡索塊莖生物堿與葉生物堿均為異喹啉生物堿，可能具有與塊莖生物堿相似的活性。在延胡索栽培過程中，延胡索葉一般以農業廢棄物處理，既造成資源浪費，也加大了環保壓力。隨著對傳統非藥用部位資源化學成分的深入研究，部分傳統非藥用部位的潛在資源價值逐漸顯現，并越來越引起人們的高度重視。已有研究表明，延胡索地上部分生物堿成分均為阿樸啡型，與地下塊莖差別較大，可能具有與塊莖不同的藥理活性。關于不同生育期延胡索葉總生物堿變化的研究鮮見報道。本研究在建立了紫外分光光度法測定延胡索葉總生物堿含量方法的基礎上，進一步分析兩年間不同生長發育時期延胡索葉的次生代謝產物動態積累規律，研究浙江道地藥材延胡索葉不同生長發育期生物堿類次生代謝產物積累規律，確定最佳采收期，為道地產區延胡索葉GAP種植、質量控制及臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

延胡索葉于2017—2019年采自浙江中醫藥大學藥學院“浙八味”研究所試驗田，經石森林教授鑒定為罌粟科植物延胡索(Corydalisyanhusuo)的干燥葉片，洗凈、殺青、烘干備用。鑒于延胡索葉的生長發育規律和生物量，采樣分以下5個時期進行：葉盛發期(3月16日)、開花初期(3月23日)、開花盛期(3月31日)、開花末期(4月8日)、葉衰老期(4月16日)。

1.2 試劑

延胡索乙素對照品(成都曼斯特生物科技有限公司，含量99.86%，批號MUST-18032720)；無水乙酸鈉(批號20160315)、無水硫酸鈉(批號2016092901，成都科龍化工試劑廠)；溴甲酚綠(批號20160817，廣東精細化學品工程技術研究開發中心)；氯仿分析純(成都科龍化工試劑廠)；甲醇為色譜純(美國Tedia公司)；其他試劑均為分析純(成都科龍化工試劑廠)。

1.3 試驗儀器

UV-Vis 2450型紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；DFY-500高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；XS105 DualRange型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；JA2003N電子天平(上海精密儀器有限公司)；MAS-Ⅱ Plus型常壓微波提取器(上海新儀微波化學科技有限公司)；FE20 pH計(瑞士梅特勒-托利多公司)；Millipore Synergy超純水系統(美國密理博公司)。

1.4 溶液的制備

對照品溶液的制備。精密稱取延胡索乙素標準品適量，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，即得187.60 μg·mL-1的延胡索乙素對照溶液。

供試品溶液的制備。精密稱取0.500 g延胡索葉粉末，測定含水量后，置于100 mL的微波提取器中，加入50 mL pH為3.0的醋酸鹽緩沖液，在70 ℃ 350 W的微波條件下提取20 min，冷卻后進行抽濾，精密移取10 mL的續濾液，用濃氨水調節pH至8.0，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于蒸發皿中，在80 ℃條件下減壓旋轉蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。

1.5 顯色方法和測定波長選擇

1.5.1 顯色試驗

依次在分液漏斗中加入12 mL pH為4.5的緩沖液，3 mL溴甲酚綠溶液，1 mL樣品及9 mL氯仿，振蕩均勻，靜置半小時后，將氯仿層放于盛有0.4 g無水硫酸鈉的10 mL離心管中。

1.5.2 波長選擇

取顯色后的延胡索乙素對照品溶液與供試品溶液，以氯仿為空白參比溶液，在200～600 nm波長掃描，在411 nm處標準品與供試品均具有最大吸收峰，故選擇測定波長為411 nm。

1.6 延胡索乙素標準曲線的制備

精密吸取1.4節中配制的對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，進行顯色試驗，在411 nm處測定吸光度；以延胡索乙素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.005 2X-0.019 09(R2=0.999 8，n=6)。結果表明，延胡索乙素在18.760～187.600 μg·mL-1范圍內吸光度與濃度的線性良好。

1.7 精密度、穩定性、重復性試驗

取1.4節中配制的對照品溶液，進行顯色試驗后，在同一條件下連續測定6次，測得相對標準差為0.12%，表明方法精密度良好。

1.4節中配制的對照品溶液進行顯色試驗，在411 nm波長處每隔20 min測定1次吸光度，連續測定6 h，測得相對標準差為0.3%，表明顯色后的延胡索乙素在6 h內穩定性良好。

按1.4節方法處理供試品，平行制備6份，進行顯色試驗，在411 nm處測定吸光度，測得相對標準差為1.90%。結果表明，試驗的重復性良好。

1.8 加樣回收試驗

精密稱定9份延胡索葉片粉末0.25 g，分別置于100 mL的微波提取器中，分別加入樣品總堿含量的80%、100%、120%延胡索乙素標準溶液，顯色后，在411 nm處測定吸光度。

1.9 不同發育期延胡索葉生物堿含量測定

精密稱取不同發育期的延胡索葉片粉末0.5 g，平行3份，測定含水量，置于100 ml的微波提取器中，按1.4節方法制備供試品溶液，在411 nm處測定吸光度，計算總生物堿含量，試驗處理及數據測定均重復3次，取其平均值，方差分析均采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 回收率

表1顯示，平均加樣回收率為99.2%，相對標準差為3.0%，表明加樣回收率良好。

2.2 不同發育期延胡索葉生物堿含量

表2顯示，延胡索葉總生物堿連續2年含量動態變化呈整體下降趨勢，即從葉盛發期到葉衰老期，總生物堿含量逐漸降低，尤其初花期到盛花期下降顯著。

表1 樣品的回收情況

表2 不同發育期延胡索葉總生物堿含量變化

3 討論

隨著對傳統非藥用部位資源化學成分的深入研究，部分傳統非藥用部位的潛在資源價值逐漸顯現，并越來越引起人們的高度重視，如銀杏葉、杜仲葉等逐漸演化為藥用，成為中藥體系中的新增品種。人參莖葉、花、果序等均含有與人參相似的資源性化學成分，具有較高的藥用及保健價值。開發利用使人參各組織部位的資源價值得到充分釋放，人參資源經濟產業鏈得到有效延伸。黃芩莖葉、地黃莖葉均已開發形成成藥，并實現產業化[23-24]。研究顯示，在延胡索葉生長發育過程中，某些時期總生物堿含量可達20 mg·g-1以上，幾乎與延胡索塊莖生物堿含量相當，這為延胡索葉開發入藥提供了物質保證。

中藥材有效成分多為次生代謝產物，不僅與植物所處的生長發育時期有關，而且是與環境相互作用的產物，在植物提高自我保護和生存競爭能力、協調與環境關系上充當著重要角色，其產生和變化比初生代謝產物與環境有著更強的相關性[25]。由于延胡索是多年生的草本植物，各生育階段是連續不斷且相互重疊的?？蓪⒀雍鞯纳L發育階段簡單分為塊莖萌芽期、葉初發期、葉盛發期、開花初期、開花盛期、開花末期、葉衰老期、塊莖休眠期八個時期，考慮后期資源開發利用，本研究只對中間幾個關鍵時期葉總生物堿含量進行了含量測定，至于不同時期總生物堿成分的差異仍需進一步研究。

生物堿是植物長期生態環境適應過程中形成的一類次生代謝產物。由于次生代謝產物含量只有在初級代謝中間產物積累到一定程度并在調節次生代謝的酶促作用下才會出現高峰[26]。葉盛發期、開花初期這2個時期由于光照充足，雨量充沛，光合作用的速率較高，因此，延胡索生長迅速，代謝旺盛。此時也容易遭受食草動物、微生物侵害，所以生物堿等次生代謝產物需要維持較高水平。延胡索作為夏季休眠的多年生植物，生長進入盛花期后期，光照強度增加和日照時間延長，地下塊莖快速膨大，體內累積的物質開始分解、轉化，葉片中生物堿等次生代謝產物含量不斷降低轉移至塊莖中。本研究表明，延胡索葉片總生物堿含量隨植株的生長發育而波動，而浙江傳統采收期(5月上旬)的生物堿含量最低。因此，針對不同生長發育期延胡索的次生代謝產物積累變化的研究是必要的。