呋蟲胺對環(huán)境生物的急性毒性與安全性評價

柳新菊，吳聲敢，安雪花，呂露，蔣金花，李崗，王菲迪，趙學平

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

呋蟲胺(dinotefuran)是由日本三井化學開發(fā)并于2002年上市的第三代新煙堿類殺蟲劑，主要作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，進而阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導，引起害蟲麻痹，從而發(fā)揮殺蟲作用[1-3]。由于其廣譜殺蟲性和良好的內(nèi)吸滲透作用，近年來呋蟲胺使用量逐年上升，有關其使用技術和對環(huán)境的影響已引起廣大科研人員的關注。

本研究以意大利蜜蜂、日本鵪鶉、斑馬魚、家蠶和赤子愛勝蚯蚓為試驗對象，按照我國《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[4]的要求，研究呋蟲胺對上述環(huán)境模式生物的急性毒性，并進行安全評價。通過系統(tǒng)研究呋蟲胺對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中典型環(huán)境生物的急性毒性，評價其安全性，從而為其合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3%呋蟲胺低容量液劑，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所農(nóng)業(yè)投入品應用評價研究中心提供。

意大利蜜蜂由浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂廠引入；家蠶品種為菁松×皓月，由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗檢疫站提供；斑馬魚為本機構(gòu)繁殖，種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心；赤子愛勝蚯蚓購自浙江省杭州市花鳥市場鑫源漁具；日本鵪鶉由杭州市蕭山區(qū)城廂鎮(zhèn)漢良畜禽養(yǎng)殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂毒性試驗

采用點滴法進行毒性試驗。選用個體大小一致的健康成年工蜂，在25.0～25.4 ℃、相對濕度53.0%～54.0%條件下進行試驗。試驗設計包括：5個呋蟲胺處理組(點滴0.250 0、0.179 0、0.128 0、0.091 1、0.065 1 mg·L-1呋蟲胺溶液)、助劑對照組(點滴丙酮溶液)和空白對照組(不進行點滴處理)，每個處理3個重復，每個重復10只蜜蜂。試驗時，呋蟲胺處理組用手動微量點滴儀對準每只蜜蜂中胸背板處分別點滴不同試驗藥液1 μL，助劑對照組點滴丙酮1 μL，待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中，用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水溶液(m/m)，通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食；空白對照組直接飼喂50%蔗糖水溶液。觀察并記錄受試蜜蜂24、48 h的中毒癥狀與死亡數(shù)。

1.2.2 家蠶毒性試驗

采用浸葉法進行毒性試驗。選擇個體大小一致的2齡起蠶，在25.0～25.5 ℃，相對濕度78%～82%的條件下進行試驗。試驗設計包括：6個呋蟲胺處理組和空白對照組，每個處理3個重復，每個重復20頭2齡起蠶。試驗時，分別將整張桑葉浸沒于不同濃度的試驗藥液(呋蟲胺濃度分別為1.800、1.500、1.250、1.040、0.868、0.723 mg·L-1)中浸泡10 s，自然晾干后剪成長條形并轉(zhuǎn)入直徑為9 cm培養(yǎng)皿中，將家蠶挑入培養(yǎng)皿后置于植物培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，所有試驗用蠶在25 min內(nèi)完成轉(zhuǎn)入；對照組桑葉不做處理。觀察并記錄受試家蠶24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡情況。

1.2.3 斑馬魚毒性試驗

試驗前，在水溫21.0～25.0 ℃，光照與黑暗時間比為14 h∶10 h，曝氣充氧的環(huán)境條件下馴養(yǎng)斑馬魚7 d以上，試驗前1 d停止喂食。試驗時，選擇大小一致(體長2.20～2.60 cm、體質(zhì)量0.071～0.110 g)的斑馬魚作為受試動物。試驗在橢圓形玻璃魚缸(無硅膠接縫，容積為9 L)中進行，每缸放入3 L試驗溶液，水溫22.5～23.4 ℃，pH 7.56±0.14，溶解氧≥78.3%。采用半靜態(tài)法進行試驗，每24 h更換試驗溶液。試驗設置5個呋蟲胺處理組(呋蟲胺濃度為2.00、1.74、1.51、1.32、1.14 mg·L-1)和空白對照組(試驗溶液為水)，每個魚缸為1個處理，每個處理20尾斑馬魚。觀察并記錄受試斑馬魚24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡情況。用玻璃棒輕觸斑馬魚尾部，無可見運動即為死亡，及時清除死亡斑馬魚。

1.2.4 蚯蚓毒性試驗

采用人工土壤混藥法進行毒性試驗。將呋蟲胺配置成5個濃度梯度(5.21、4.00、3.08、2.37、1.82 mg·kg-1)，分別在1.5 kg人工土壤(由泥炭蘚、高嶺土、工業(yè)沙和碳酸鈣按一定比例組成，含水量2.52%)中加入450 mL試驗溶液，攪拌混勻后各分為3份，置于500 mL燒杯中，每個燒杯中接入10條蚯蚓(體質(zhì)量0.379～0.572 g)，放入人工氣候箱中；對照組放入未添加呋蟲胺溶液的人工土壤。試驗時，保持環(huán)境溫度20.2～21.2 ℃，相對濕度50.3%～78.6%，光照強度550～565 lx，連續(xù)光照。觀察并記錄受試蚯蚓7、14 d時的中毒癥狀和死亡情況。

1.2.5 鵪鶉毒性試驗

選擇體質(zhì)量基本一致、健康、活潑、雌雄各半的日本鵪鶉用于試驗。采用經(jīng)口一次灌注法，按100 g體質(zhì)量給藥1 mL試驗溶液，每只稱體質(zhì)量，分別給藥。正式試驗設置323 mg·kg-1共1個試驗劑量(此劑量為呋蟲胺超低容量液劑所能配制的最大劑量)，同時設置1個不加藥處理為空白對照組，每組10只健康活潑鵪鶉(雌雄各半)。供試鵪鶉給藥后，按常規(guī)方法飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度25.5～26.5 ℃，相對濕度53%～70%，排氣扇通風，光照∶黑暗時間為14 h∶10 h。觀察并記錄受試鵪鶉1、3、5、7 d時的中毒癥狀和死亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計分析軟件計算各時間點受試物的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)、半數(shù)致死濃度(median lethal concentration，LC50)及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 呋蟲胺對蜜蜂的毒性作用

呋蟲胺對蜜蜂的接觸毒性試驗結(jié)果見表1。試驗過程中，對照組蜜蜂活動正常；不同濃度呋蟲胺處理蜜蜂后，蜜蜂出現(xiàn)活動減少、行動緩慢、落地死亡等情況，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計算，呋蟲胺對蜜蜂的LD50(48 h)為0.156 μg·蜂-1。根據(jù)GB/T 31270.10—2014[4]中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分級標準，48 h時0.001 μg·蜂-1

表1 呋蟲胺對蜜蜂急性接觸毒性試驗結(jié)果

注：24 h時LD50為0.161 μg·蜂-1，95%置信區(qū)間為0.142～0.193 μg·蜂-1；48 h時LD50為0.156 μg·蜂-1，95%置信區(qū)間為0.138～0.183 μg·蜂-1。

2.2 呋蟲胺對家蠶的毒性作用

呋蟲胺對家蠶的毒性試驗結(jié)果見表2。試驗過程中，不同濃度處理家蠶出現(xiàn)發(fā)育遲緩、側(cè)倒、扭曲掙扎和死亡等情況，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計算，呋蟲胺對家蠶的毒性LC50(96 h)為1.26 mg·L-1。根據(jù)GB/T 31270.11—2014[4]中農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標準，96 h時0.5 mg·L-1

2.3 呋蟲胺對斑馬魚的毒性作用

呋蟲胺對斑馬魚的毒性試驗結(jié)果見表3。試驗過程中，不同濃度呋蟲胺處理斑馬魚出現(xiàn)游動遲緩、側(cè)翻失衡、竄動、沉底等癥狀，高濃度組的中毒癥狀較早出現(xiàn)且更加明顯。經(jīng)計算，呋蟲胺對斑馬魚的毒性LC50(96 h)為1.55 mg·L-1。根據(jù)GB/T 31270.12—2014[4]中農(nóng)藥對魚類的急性毒性等級劃分標準，96 h時1.0 mg·L-1

表2 呋蟲胺對家蠶急性接觸毒性試驗結(jié)果

注：72 h時LC50為1.35 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.28～1.45 mg·L-1；96 h時LC50為1.26 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.19～1.34 mg·L-1。

表3 呋蟲胺對斑馬魚急性接觸毒性試驗結(jié)果

注：24 h時LC50為1.83 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.69～2.15 mg·L-1；48 h時LC50為1.75 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.61～2.01 mg·L-1；72 h時LC50為1.69 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.57～1.90 mg·L-1；96 h時LC50為1.55 mg·L-1，95%置信區(qū)間為1.45～1.66 mg·L-1。

2.4 呋蟲胺對蚯蚓的毒性作用

呋蟲胺對蚯蚓的毒性試驗結(jié)果見表4。試驗過程中，不同濃度呋蟲胺處理蚯蚓7 d后出現(xiàn)體液滲出、身體腫脹和死亡等中毒癥狀。經(jīng)計算，呋蟲胺對蚯蚓的毒性LC50(14 d)為3.40 mg·kg-1。根據(jù)GB/T 31270.15—2014[4]中農(nóng)藥對蚯蚓的毒性等級劃分標準，14 d時1.0 mg·kg-1

2.5 呋蟲胺對鵪鶉的毒性作用

試驗過程中，最大呋蟲胺劑量處理后，鵪鶉均表現(xiàn)正常。經(jīng)計算，呋蟲胺對鵪鶉的毒性LD50(7 d)>323 mg·kg-1。因323 mg·kg-1為呋蟲胺按每100 g鵪鶉直接灌喂1 mL所得，為該藥劑所能配制的最大劑量，且鵪鶉均未見死亡。故評估呋蟲胺對鵪鶉7 d急性接觸毒性為低風險。

表4 呋蟲胺對蚯蚓急性接觸毒性試驗結(jié)果

注：7 d時LC50為4.07 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為3.63～4.87 mg·kg-1；14 d時LC50為3.40 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為3.08～3.81 mg·kg-1。

3 討論

在整個生態(tài)系統(tǒng)中，鳥類、蜜蜂、家蠶、魚類和蚯蚓等是非常重要的環(huán)境生物，農(nóng)藥對其毒性大小在一定程度上反映了該農(nóng)藥的環(huán)境安全性。本研究所選擇的意大利蜜蜂、家蠶、斑馬魚、赤子愛勝蚯蚓和日本鵪鶉等是目前國內(nèi)外環(huán)境生物毒理學研究的標準測試生物，被廣泛應用于環(huán)境生物毒性試驗及其安全性評價[5]。本研究進行上述一系列環(huán)境生物的急性毒性測試和安全性評價，能夠了解呋蟲胺在生態(tài)鏈各環(huán)節(jié)的危害，為呋蟲胺原藥和制劑的合理使用及登記提供科學參考。

本研究結(jié)果顯示，呋蟲胺對蜜蜂48 h的LD50為0.156 μg·蜂-1，其毒性級別為高毒，與譚麗超等[6]、季守民等[7]、陳秀[8]研究的毒性等級一致。因此，田間使用時，宜在蜜蜂低活動時期時噴施藥劑，并避免開花期，且田邊也沒有處于開花期的作物，噴施藥劑前，還需將蜂巢和蜂群搬離。呋蟲胺對家蠶96 h的LC50為1.26 mg·L-1，毒性級別為高毒，與李雙等[9]、陳偉國等[10]研究的結(jié)果一致。因此，田間使用時，宜避免在蠶室和桑園附近使用該藥劑，同時延長藥后桑葉采摘間隔期。呋蟲胺對斑馬魚96 h的LC50為1.55 mg·L-1，其毒性級別為高毒。孫琦等[11]研究了呋蟲胺對斑馬魚胚胎的急性毒性，結(jié)果顯示，呋蟲胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為10.36 g·L-1，屬于微毒，且隨著劑量增加，呈規(guī)律的劑量依賴效應。吳若函等[12]研究了20%呋蟲胺懸浮劑對斑馬魚的急性毒性，其96 h-LC50為59.7 mg·L-1，屬于低毒。張文萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)呋蟲胺制劑的毒性比原藥的毒性要高，不同劑型毒性也有差異。因此，田間使用時，應避免藥液污染水源地。呋蟲胺對蚯蚓14 d的LC50為3.40 mg·kg-1，其毒性級別為中毒，與馮磊等[14]、肖遠卓[15]的研究結(jié)果一致。田間使用時，盡量按規(guī)定劑量不會造成危害性，但應盡量避免高溫天氣使用，同時輪換使用不同的新煙堿類農(nóng)藥。呋蟲胺對鵪鶉7 d的LD50>323 mg·kg-1，用農(nóng)藥所能配制的最大劑量直接灌喂，鵪鶉均表現(xiàn)正常。

綜上所述，呋蟲胺對不同環(huán)境生物的毒性不同。農(nóng)藥對環(huán)境生物的毒性研究不應局限于急性毒性，還應研究其慢性毒性效應。本研究僅限于呋蟲胺對環(huán)境生物的急性毒性研究，而其對鳥類、蜜蜂、家蠶、魚類和蚯蚓等環(huán)境生物的慢性影響尚需進一步研究。