娑羅子中抗炎活性成分的計算機(jī)虛擬篩選

宋煒　袁橋玉　王靜　胡貝　李竣　劉新橋

摘要：利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計探究了植物娑羅子中抗炎的活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中利用里賓斯基五規(guī)則篩選出娑羅子的化學(xué)成分，用SYBYL軟件對小分子與抗炎作用相關(guān)的16個蛋白靶點進(jìn)行分子對接，通過對接打分函數(shù)（Total Score≥7）篩選出活性成分;采用Discovery Studio軟件分析了蛋白復(fù)合體的相互作用;利用admetSAR軟件分析了對接結(jié)果較好的幾個化合物的ADMET預(yù)測。結(jié)果表明：七葉皂苷苷元A與JINK3結(jié)合最好，山奈酚與iNOS結(jié)合最好，槲皮素和七葉苷與JAK1結(jié)合最好，秦皮苷ERKI、JNK3、MIF結(jié)合都好;蛋白復(fù)合體的分析結(jié)果顯示疏水作用力和氫鍵在對接中發(fā)揮重要作用。5個化合物的ADMET存在一定的不足，成藥時應(yīng)該稍加修飾使其具有更好的ADMET。此研究為中藥娑羅子化學(xué)成分的抗炎研究提供了參考，也為新藥研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：娑羅子;計算機(jī)輔助藥物設(shè)計;分子對接;ADMET預(yù)測

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（ 2020）2-0180-05

1 引言

娑羅子為七葉樹科植物七葉樹（Aesculus chinensisBge.）、浙江七葉樹（Aesculuschinewis Bge. var. cheLzi-angensis（ HuetFang） Fang）或天師栗（Aesculus wil.soniiRehd.）的干燥成熟種子;均作為常用中藥收入到《中國藥典》。其性溫，味甘，歸肝、胃經(jīng)，具有疏肝、理氣、和胃、止痛之功效[1]。娑羅子具有抗炎消腫作用[2]，但是確切的抗炎靶點和作用機(jī)制尚未報道。通過常規(guī)篩選和高通量篩選需要大量的人力和物力，而計算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計（ computer- aided drug design，CADD）是利用計算機(jī)化學(xué)基本原理，通過模擬藥物與受體生物大分子的相互作用，合理設(shè)計新型先導(dǎo)化合物的藥物設(shè)計方法，它的使用也極大地減少了新藥創(chuàng)制的盲目性和偶然性[3]。根據(jù)配體與受體作用的“鎖匙原理”，分子對接可以有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物;目前，計算機(jī)輔助藥物設(shè)計已廣泛運(yùn)用于中藥及其復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制的研究[3]。

藥物開發(fā)中不良的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)和毒性（ ADMET）是藥物開發(fā)失敗的主要原因之一，因此在藥物研發(fā)的早期，即對化合物的ADMET性質(zhì)進(jìn)行評價，以便將具有不良ADMET性質(zhì)的化合物盡早排除，這樣能有效降低藥物開發(fā)的失敗率。但實驗評價化合物的ADMET性質(zhì)，代價大、周期長，且動物數(shù)據(jù)與人體數(shù)據(jù)并不完全一致，因而不能滿足現(xiàn)代藥物研究的需求。最經(jīng)濟(jì)合理的辦法是使用計算機(jī)模型對ADME-性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，這樣的預(yù)測可以放在化合物成藥之前進(jìn)行，因此具有重要的研究意義[4]。

因此，本實驗基于分子對接技術(shù)和ADMET預(yù)測，從中藥娑羅子中篩選抗炎活性的天然配體的可能作用靶點，為今后開展研究娑羅子抗炎作用機(jī)制和新藥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和參考。

2 材料與方法

2.1 程序系統(tǒng)

蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB，美國紐約結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究實驗室開發(fā)，http：//www. rcsb. org/pdb/home/home.do）;Sybyl l.0軟件（美國Tripos公司）;Discovery Stu-di0 2017 R2 Client（DS，美國Accelrys公司開發(fā)，ht-tps：//www. 3dsbiovia. com/）。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（ TCMSP，http：//lsp. nwu. edu. cn/tcmsp.php）;小分子化合物結(jié)構(gòu)下載（PubChem，美國國家生物技術(shù)信息中心，下載網(wǎng)址：https：//pubchem. ncbi. nlm.nih. gov/）; admetSAR（ http： //lmmd. ecust. edu. cn/ad-metsarl）;ChemDraw。

2.2 方法

2.2.1 配體的準(zhǔn)備

配體分子信息鍵見表1。以“娑羅子”為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索娑羅子的化學(xué)成分，加以I_ipin-ski限制（里賓斯基五規(guī)則指的是氫鍵供體不超過5（Hon≤5），氫鍵受體不超過10（HAcc≤10），脂水分配系數(shù)（ALogP）在-2～5之間，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)的數(shù)量（RBN）不超過10，分子量（MW）小于500[5]），篩選出12個候選化合物。從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)，未能在Pubchem下載的化合物用ChemDraw2D畫出其結(jié)構(gòu)，并用Chem3D轉(zhuǎn)為m012格式，建立配體小分子配體化合物庫。所有配體小分子均采用分子力學(xué)程序中的Minimize進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，賦予Tripos力場及Gasteiger- Huckel電荷，以Powell能量梯度法進(jìn)行能量優(yōu)化，最大重復(fù)次數(shù)為10000次，優(yōu)化后得到穩(wěn)定構(gòu)象并保存m012格式，為后面分子對接做準(zhǔn)備。

2.2.2 靶點的準(zhǔn)備

根據(jù)文獻(xiàn)[3，6～11]報道選取了16個與炎癥相關(guān)的靶點蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載這16個蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，具體蛋白靶點見表2。對下載的靶蛋白在SYBYL軟件中用Application中的Docking模塊進(jìn)行去水、加氫，加電荷;并根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中的配體確定對接的活性位點，并將處理好的蛋白保存，為后續(xù)分子對接研究做準(zhǔn)備。

2.2. 分子對接

以16個抗炎蛋白靶點作為受體，12個小分子化合物為配體在SYBYLI.O軟件中Surflex - dock模塊進(jìn)行分子對接。對接結(jié)果以對接總得分（ Total Score）呈現(xiàn);Total Score用來反應(yīng)配體與受體的親和力大小，它綜合考慮到了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大，對接復(fù)合物越穩(wěn)定，說明小分子配體與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合的越好。Total Score≥7認(rèn)為小分子配體與靶點蛋白結(jié)合活性較好[12]。采用DS軟件中Re-ceptor- Ligand Interactions模塊對分子對接的結(jié)果進(jìn)行分析，并制作二維和三維的效果圖。

2.2.4

ADMET預(yù)測

根據(jù)分子對接的結(jié)果，選擇對接打分高的小分子配體進(jìn)行ADMET預(yù)測，在admetSAR數(shù)據(jù)庫中輸入小分子配體的Smiles格式，然后點擊Predict即可得到該小分子配體有關(guān)數(shù)據(jù)，主要包括血腦屏障通透性（ BBB），人腸道吸收（ HIA），人腸細(xì)胞系滲透性（Cac02 Cell per-meability，CCP），細(xì)胞色素（CYP）酶系的抑制性，AMES測試用于檢測可能的誘變劑（ATT），致癌性（Carcino-genicity，Carcino），50%大鼠的致死量（LD50 in Rat）。

3 結(jié)果

3.1 分子對接結(jié)果

從上述得到的候選化合物的分子對接結(jié)果來看，篩選出七葉皂苷苷元A與C - jun N- terminal kinase 3（JNK3）結(jié)合最好，山奈酚與誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iN-OS）結(jié)合最好，槲皮素與酪氨酸激酶1（JAKI）結(jié)合最好，七葉苷與酪氨酸激酶I（JAKI）結(jié)合最好，秦皮苷與Extracellular signal regulated kinase l（ERKI）、C-junN- terminal kinase 3 （JNK3）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）結(jié)合都好。由表3對接結(jié)果可知，多成分對多靶點蛋白共同作用的特點，為娑羅子的抗炎作用機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ);同時，各成分也可作為相應(yīng)靶蛋白抑制劑的先導(dǎo)化合物加以研究。具體的對接打分見表3。

3.2 對接結(jié)果分析

5個候選化合物與對應(yīng)的炎癥靶點之間形成的氫鍵與疏水作用見表4。以對接打分最高化合物12（秦皮苷）與ERK1相互作用蛋白復(fù)合物為例做它們間相互作用力的分析圖（圖1、圖2）。

從圖2可以看出，秦皮苷與氨基酸殘基LEU173、ALA69、VAL56有疏水相互作用力，與殘基GLU50、GLY54、CYS183、ASP184、SER170形成了氫鍵。

3.3 ADMET預(yù)測結(jié)果

5個具有潛在抗炎活性分子的ADMET預(yù)測結(jié)果見表5。

BBB的陽性結(jié)果代表藥物分子能輕易透過血腦屏障，接近1的值表示透過BBB的更好的滲透性，陰性結(jié)果代表不能輕易透過血腦屏障;腸是吸收口服藥物的的主要部位，HIA的陽性結(jié)果表明它們的化合物可以通過人腸吸收或同化，接近1的值表示通過腸更好的吸收。CCP的陽性結(jié)果代表能輕易透過人腸細(xì)胞系，接近1的值表示透過CCP的更好的滲透性。AMES測試值“None”代表該化合物無誘變毒性，“AMES toxic”代表該何物有誘變毒性。Carcino代表致癌性。LD50 inRat的值代表著能使半數(shù)老鼠死亡的所需的最低化合物濃度（單位：mol/kg），其數(shù)值越大代表該化合物成藥后安全性更高。

3.4 ADMET結(jié)果分析

七葉皂苷苷元A、山奈酚與七葉苷能透過血腦屏障，槲皮素與秦皮苷不易透過血腦屏障;5個候選化合物均能經(jīng)人腸吸收或同化，其中七葉皂苷苷元A、山奈酚與槲皮素能很好地經(jīng)人腸吸收或同化;秦皮苷易透過人腸細(xì)胞系，具有很好地滲透性，其它4個候選化合物不易透過人腸細(xì)胞系，但秦皮苷具有誘變毒性;5個化合物均無致癌性。山奈酚與槲皮素對細(xì)胞色素（ CYP）酶系具有高抑制，七葉皂苷苷元A、七葉苷與秦皮苷對細(xì)胞色素（CYP）酶系的抑制性低。綜上可得5個候選化合物在人體的吸收、分布、代謝、排泄和毒性某一個方面或多個方面存在的問題。成藥時應(yīng)該考慮其AD-MET性質(zhì)，對其結(jié)構(gòu)稍加修飾，使其化合物有更好的ADMET性質(zhì)，在人體內(nèi)有適宜的吸收、分布、代謝、排泄且無毒。

4 結(jié)論

本研究以Sybyl軟件的Surflex- dock模塊對娑羅子中的12個化學(xué)成分與16個炎癥靶點對接，虛擬篩選出七葉皂苷苷元A、山奈酚、槲皮素、七葉苷、秦皮苷5個化合物具有抗炎活性的小分子化合物（ Total score≥7）。從計算機(jī)虛擬篩選的角度驗證中藥娑羅子具有抗炎作用的化學(xué)成分，為闡述娑羅子抗炎機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。然后應(yīng)用Discovery Studio Visualizer軟件對對接結(jié)果最好的蛋白復(fù)合物的相互作用力進(jìn)行分析，說明疏水作用與氫鍵在分子對接中起著重要的作用。最后對篩選的5個化合物做ADMET預(yù)測，ADMET的預(yù)測可以給新藥研發(fā)的成藥過程中的給予一定理論指導(dǎo)和幫助。綜上所述：計算機(jī)輔助藥物設(shè)計和ADMET預(yù)測不僅顯著提高了藥物設(shè)計速度，還減少了新藥創(chuàng)新所需要的人力與物力，提高了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)率和成藥的可能性，為中藥的抗炎活性奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]尉芹，馬希漢，楊秀萍，等.娑羅子化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2003（4）：126-129.

[3]張金杰，呂文文，孫迎東，等.野菊花中黃酮類成分抗炎活性的虛擬篩選[J].藥學(xué)研究，2018，37（10）：565-571

[4]唐赟.藥物ADMET性質(zhì)的計算機(jī)預(yù)測研究[C]∥中國化學(xué)會，第十一屆全國計算機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集，北京：中國化學(xué)會.2011：2.

[5]徐莜杰，侯延果，喬學(xué)斌，等.計算機(jī)輔助藥物設(shè)計[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[6]張浩，昝金行，龍偉，等，基于分子對接方法的中藥抗炎機(jī)制研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31（12）：1542-1546。

[7]Qing S， Li C， Wen J H， et al.A review of inflammatory signallngpathway regulated acupuncture [J]. World Journal of Acupuncture - Moxibustion， 2016， 26（2）：63-69.

[8]高世超，殷海波，劉宏瀟，等.MAPK信號通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].中國骨傷，2014，27（5）：441-444.

[9] Haoyang Li， ShengWang， Zhe Qian， et al. MKK6 from pacificwhite shrimp Litopenaeus vannamei is responsive to bacterlal andWSSV infection [J]. Molecular Immunology， 2016（ 70）.

[10]張浩浩，葉曉川，胡春玲，等，菝葜中抗炎活性成分的虛擬篩選[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，20（5）：44-47.

[11]朱銳靈，沈悅，馬飛鴻，等.分子對接技術(shù)在中藥抗炎活性成分篩選和作用機(jī)制研究中的應(yīng)用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2018，32（6）：497～506.

[12]宋小地，翟西峰，馮家星，等，桑白皮和桑葉中a一葡萄糖苷酶抑制劑的虛擬篩選[J].中國藥房，2017，28（4）：508-511.

作者簡介：宋煒（1993-），男，碩士研究生，研究方向為藥物化學(xué)。

通訊作者：劉新橋（1978-）.男，副教授，博士，研究方向為天然藥物化學(xué)。