辣椒抗白粉病基因CaML04的克隆和表達分析

肖仲久　李小霞　宋培勇

摘要：MLO基因是植物中特有的一類抗病負調控因子，該基因突變導致植物產生廣譜抗病性。為研究MLO基因在辣椒中表達模式及功能分析，以前期本課題組通過SSH文庫獲得的ESTs，設計引物，采用RT- PCR和RACE的方法，成功克隆了一個CaML04基因，并對該基因的特性和表達模式進行了初步分析，結果顯示了該CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調控過程。

關鍵詞：辣椒;MLO基因;表達分析

中圖分類號：S641 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944 （2020） 2-0188-03

1 引言

辣椒在我國栽培面積約100多萬hm2[1]婦，面積居蔬菜的第二位，消費人群高達5億多人[2]。在我國，以貴州、湖南、重慶等16個省份為重點辣椒種植區，辣椒產業已經成為我國許多省區農業增效和農民增收的一條重要途徑。辣椒白粉病（Leveillula taurica）是一種世界性病害，已經相繼在我國各辣椒產區普遍發生[3-6]。

MLO基因最早是在禾本科植物類中描述的，MLO家族成員在單子葉和雙子葉植物中起到調節宿主對白粉病菌響應的作用[7，8]。學者們目前已對擬南芥、水稻、玉米和楊樹中的Mlo基因家族有深入的研究，而在辣椒中報導較少。因此，本研究以前期獲得的ESTs，設計引物，采用RT- PCR和RACE的方法成功克隆了一個CaML04基因，并對其序列特性和表達模式進行了初步的分析，以期為辣椒CaML04基因在辣椒抗病分子育種中的應用提供依據[9]。

2 材料與方法

2.1 材料及處理

實驗所用抗病辣椒材料為‘遵辣一號。辣椒培養條件及白粉菌接種等方法參考文獻[10]。

2.2 RNA提取和cDNA第一鏈合成

所有辣椒組織在液氮中磨成粉末。總RNA用Tr-izol -步法抽提試劑盒提取，參照TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA第一鏈。

2.3 CaML04基因的克隆及測序

利用課題組前期獲得的辣椒ESTs數據，設計引物，以“遵椒一號”的cDNA為模板，采用TaKaRa公司的RACE及RT- PCR試劑盒，克隆獲取基因的全長序列。條帶割膠后用TaKaRa DNA凝膠回收試劑盒進行回收、純化，再用TaKaRa公司的pMD18-T對回收、純化后的片段進行連接，挑取陽性克隆送諾賽基因公司測序。

2.4 生物信息學分析

在NCBI網站（http：//www，ncbi.nlm. nih.gov/）上BLASTp進行蛋白預測，利用Specialized BLAST（ CDDsearch）進行保守域分析。在蛋白生物信息學網站（ http：//www. expasy.org/proteomics）上對CaM-L04蛋白進行理化性質、親/疏水性、跨膜結構及三級結構預測和分析。

2.5 CaML04基因的表達分析

2.5.1 半定量RT- PCR分析

根據CaML04測序結果，利用Primer Premier5.00軟件設計引物，檢測了CaMLO4基因在接種辣椒白粉菌后不同時間點的表達模式，以辣椒Actin基因為內參調整半定量RT- PCR的模板用量。RT- PCR反應的體系為25μL，包括：經內參調整的適宜體積的cD-NA模板，10×PCR buffer 2.5μL， MgC12 （25mol/L），dNTP（IO mmol/L）0.5μL，正向引物（10 mmol/L）1μL，反向引物（10 mmol/L）1μL，Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，ddH20補足至25μL。反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環（擴增平臺期前），最后72℃延伸5 min。

2.5.2 Norther雜交驗證

經過探針標記、標記效率檢測、RNA變性電泳、RNA印跡轉移、雜交、洗膜、雜交顯色及拍照等步驟，分析Norther雜交結果。

3 結果與討論

3.1 完成辣椒總RNA的提取及反轉錄

高質量的總RNA是構建cDNA文庫的首要前提。本試驗采用Trizol 一步法抽提試劑盒（稍作改良）提取辣椒葉片的總RNA，紫外分光光度計測定OD260/OD280為1.9～2.0，表明所提取的總RNA純度較高，質量較好，基本沒有蛋白質和DNA殘留;利用1.2%的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S、18S和5SrRNA條帶清晰、無拖尾，且28S帶的亮度約為18S的1.5～2倍;說明所提取的總RNA其完整性較好，所提取的RNA未出現降解，質量較好，根據260nm處的光吸收值計算RNA樣品的濃度，稀釋RNA濃度至100 ng/μL以備用。為后續進行反轉錄實驗提供了可能（圖1）。

3.2 辣椒CaML04基因的克隆

以課題組前期獲得的CaMLO基因的ESTs片段為設計引物，利用RT -PCR和RACE技術，通過多次擴增、產物克隆和測序等手段，從辣椒材料中克隆獲得了1個CaML04全長序列。CaML04基因的cDNA序列全長為1637 bp，包括1515 bp的ORF，其ORF編碼一個含有504個氨基酸的蛋白質。

CaML04基因編碼的氨基酸：

MGNLEGASFSETPTYAVATVVTVI_VSIGFI_IH GSLKKFGKWLHKTKREPLYAALEKIKEELMVFGL LSLLMGHWIIYVAKICVKASAVSSHFYPCSPPRNK TESAITRFVI_SGSSYSNFSISRLLLSSGHVNYCPE GLQSFASKESLEQLHRFLLVL_GVSHVSYSFFAIAL AMIKIYSWRTWENNAKSMALQRLEGSEEPVANN TRMGRLSTFTFH HTTHPWSQHRAI_VWLLCFSR QFWSSINEADYMALRLGFITTHQLPLTYDFHKY MLRSMEEEFRDIVGISVPLWIFVII.CVFLSFHGTN IYFWISFFPAILILLVGTKLHRVVVKLAVEIMDSSP LEGFHQFNLRDELFWFGKPRFLLRIIQFISFQWE IKGASCFTENHTFl_VIRLSFGVlsoFWCSFVTFP LYVIVAQMGSRYKKTIVSENVRTSLHGWRHKVK ARLEGSVVSPETLLAATSLDSMEEDEADQIHTIVS DQHVTLEQSCTNEISECDELHIPLSPRI

3.3 生物信息學分析

利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預測CaML04蛋白的理化性質，結果表明：該蛋白的分子式為C2659H4075N6830715S21，由8153個原子組成，分子質量為57724. 01，氨基酸總數為504，含量最多的是亮氨酸（11.5%），其次是絲氨酸（10.7%）、笨丙氨酸和纈氨酸（7.3%）;帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）為43，帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）為46，說明該蛋白帶正電荷;總平均親水性（ GRAVY）為0.176，為疏水性蛋白;理論等電點為8. 29，為偏堿性蛋白;摩爾消光系數為24930，在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h，不穩定指數為43. 38，脂肪指數為98. 61，根據Gu-ruprasad方法表明CaML04為不穩定蛋白。利用在線軟件ExPASy中的ProtScale程序預測CaML04蛋白的親水性/疏水性（圖2），294位點處有最大值為3. 678，100位點處有最小值為-2. 322，故CaML04蛋白為疏水性，與理化性質預測的結果一致。

跨膜結構域是膜中蛋白與膜脂結合的主要部位，一般由20個左右的疏水氨基酸殘基組成，形成a螺旋，與膜脂相結合。預測和分析跨膜結構域對認識蛋白質的結構、功能、分類以及在細胞中的作用部位均存在一定的意義。利用TMHMM2.O Serve在線軟件對CaM-L04基因的氨基酸進行了跨膜結構域的分析。如圖3所示，CaML04蛋白的跨膜結構預測結果均顯示包含6個跨膜結構（ seven- TM）。CaML04蛋白的6次跨膜結構域，分別在15 - 35，61- 83， 157 - 179. 281 - 300，305-322，392-414個氨基酸處形成跨膜的結構域。

利用 NCBI 中的 Conserved Domain Database（ CDD）數據庫對CaML04蛋白的保守結構域進行預測，結果顯示（圖4）該蛋白為MLO蛋白超家族成員。利用在線軟件PSORT II Prediction分析CaML04蛋白的亞細胞定位，發現該蛋白在plasma membrane中分布最多，達60. 9%，其次為endoplasmic reticulum和vacuolar，達13.0%，再次是nuclear，mitochondrial，Golgi中也有分布，達4.3%。利用在線軟件SWISS-MODEI。對CaML04蛋白進行同源模建，預測其三級結構模型，其最佳模型是（圖5），序列一致性為23. 08%;另一模型是4ib4.1，A。

3.4 CaML04基因表達模式分析

RT- PCR分析表明（圖6），樣品在35個循環時就有大量擴增產物出現，說明供試基因在白粉菌接種后的cDNA群體中表達豐度較高，在未接種白粉時CaML04基因有一定的本底表達，接種白粉病菌后24 h表達量開始升高，36 h時達到最大，后續出現了較明顯的下調，基因的Northern雜交中（圖7），可以看出，在oh時就略微有表達，在36h時開始增加，并且在以后的48h表達量最高，與RT- PCR驗證有一些區別。這與已經報道的擬南芥和甜瓜MLO基因表達模式相似，說明CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調控過程。

4 結論

白粉病是辣椒生產上重要的病害之一，主要是葉片受害。抗病育種是解決辣椒白粉病的一種有效方法[11]。MLO是植物所特有且廣泛存在的基因家族，不同植物中的MLO家族成員數差異較大，但其中多數MLO基因的功能尚不明確[12，13]。研究發現，本研究克隆的CaML04受到白粉病菌的誘導，在未接種白粉時CaML04基因有一定的本底表達，接種白粉病菌后24h表達量開始升高，36～48 h時達到最大，后續出現了較明顯的下調，說明CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調控過程，推測其為辣椒白粉病抗性相關基因，目前CaML04的功能作用仍在進一步研究中。因此，通過對辣椒ML04基因的克隆及序列特性的分析，可為后續MLO基因在辣椒抗病分子育種中的應用提供重要信息。

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作者簡介：肖仲久（1980-），男，教授，研究方向為植物病理學。