銀杏葉注射液對丙泊酚麻醉引起的大鼠認知功能障礙的影響

胡雅娟 胡格吉胡 石海霞 賀娜 杜雪江 王利

摘要 目的：觀察銀杏葉注射液對麻醉引起的認知功能障礙的影響。方法：將75只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、銀杏葉組、抑制劑組、激動劑組，每組15只。銀杏葉組、抑制劑組、激動劑組從麻醉前3 d腹腔注射銀杏葉注射液（2 mL/kg），1次/d，連續給藥3 d;抑制劑組在麻醉前腹腔注射EX527（5 mg/kg）;激動劑組在麻醉前腹腔注射SRT1720（200 mg/kg）。水迷宮觀察認知功能程度，觀察大鼠腦組織神經元形態學變化，透射電鏡觀察腦組織組織超微結構，檢測Iba-1、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、MDA、SIRT1、NF-κB、IκB-α、Bcl-2、Bax、Caspase-3指標變化。結果：與模型組、抑制劑組比較，銀杏葉組和激動劑組大鼠逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數增多、腦組織神經細胞形態改善，突觸數量增多，SIRT1、IκB-α、Bcl-2、SOD表達升高，IκB-α、Bax、Caspase-3、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA表達降低（P<0.05）;與銀杏葉組比較，激動劑組的上述情況均較優（P<0.05）;與模型組比較，抑制劑組的上述情況均較優（P<0.05）。結論：銀杏葉注射液改善麻醉引起的認知障礙，其機制之一可能通過SIRT1/NF-κB通路介導。

關鍵詞 銀杏葉注射液;丙泊酚麻醉;認知功能障礙;SIRT1/NF-κB通路

Effects of Ginkgo Biloba Injection on Cognitive Impairment Induced by Propofol Anesthesia in Rats and Its Mechanism

HU Yajuan1，HU Gejihu1，SHI Haixia1，HE Na1，DU Xuejiang1，WANG Li2

（1 Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China; 2 Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China）

Abstract Objective：To observe the effects of ginkgo biloba injection on cognitive dysfunction induced by anesthesia.Methods：A total of 75 rats were randomly divided into a normal control group（n=15），model group（n=15），a ginkgo biloba group（n=15），an inhibitor group（n=15）and an agonist group（n=15）.Ginkgo biloba group，inhibitor group and agonist group were injected intraperitoneally with ginkgo biloba injection（2 mL/kg）once a day for 3 days before anesthesia，EX527（5 mg/kg）was injected intraperitoneally before anesthesia in inhibitor group，and SRT1720（200 mg/kg）was injected intraperitoneally before anesthesia in agonist group.The degree of cognitive function and the morphological changes of hippocampal neurons were observed by water maze，the ultrastructure of hippocampus was observed by transmission electron microscope，and the changes of Iba-1，IL-6，IL-8，TNF-α，SOD，MDA，SIRT1，NF-κ B，I κ B-α，Bcl-2，Bax and Caspase-3 were detected.Results：Compared with the model group and inhibitor group，the escape latency in ginkgo biloba group and agonist group was shorter，the number of crossing platform was higher，the morphology of hippocampal nerve cells improved，the number of synapses and the expression of SIRT1，I κ B-α，Bcl-2，SOD increased，and the expression of I κ B-α，Bax，Caspase-3，IL-6，IL-8，TNF-α and MDA decreased in ginkgo biloba group and agonist group（P<0.05）.Compared with the ginkgo biloba group，the above conditions in the agonist group were better than those in the model group（P<0.05），and those in the inhibitor group were better than those in the model group（P<0.05）.Conclusion：Ginkgo biloba injection can improve the cognitive impairment induced by anesthesia，and one of its mechanisms may be mediated by SIRT1/NF-κ B pathway.

Keywords Ginkgo biloba injection; Propofol anesthesia; Cognitive impairment; SIRT1/NF-kappa B pathway

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.017

50年年代始，術后認知功能障礙（Postoperative Congnitive Dysfunction，POCD）逐漸引起研究人員的重視[1]。一項大型流性病學調查研究顯示約25.8%的手術患者在術后1周均發生了POCD，直至術后3個月仍有近10%的患者存在POCD[2]，雖然部分學者認為POCD具有自限性，但仍有大量學者證實POCD的存在增加了術后第一年內死亡的風險，且導致患者過早喪失勞動力和社會獨立能力[3-4]。丙泊酚是目前臨床最常用的麻醉藥物，其以起效快、作用時間段、清除迅速等特點被廣泛應用于各科手術中，但其導致的POCD臨床時有報道。

POCD屬于中醫“呆病”“善忘”“健忘”等范疇，腦髓空虛、神機失用是該病的主要病機，張景岳在注釋《素問·刺禁論》中“刺頭，中腦戶，立死”解釋到“腦為髓海，乃元陽精氣之所聚”，可見腦髓為主宰神志之根本。多數POCD為老年患者，多有髓海不足，腦髓不充，勢必影響腦主神志之功，從而導致POCD的發生發展。銀杏葉是重要的中藥藥材，有活血化瘀通絡，化濁降脂之功。現代藥理研究及臨床文獻[5-7]均證實銀杏葉注射液可有效改善認知功能減退性疾病，但其作用機制目前尚無統一定論。為了進一步明確銀杏葉注射液改善POCD的作用機制，本研究以吸入丙泊酚來誘導高齡大鼠發生POCD，以其為媒介探討銀杏葉注射液丙泊酚所致POCD的療效及可能機制，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠，體質量（230±20）g，由中國中醫科學院中藥研究所提供[合格證號：SYXK（京）2017-0003]。所有大鼠均在內蒙古醫科大學實驗動物中心適應性喂養5 d后進行模型制備。飼養環境：溫度（23±3）℃，濕度（50±1）%。食物和水在整個實驗過程中均由實驗動物自由索取。實驗經內蒙古醫科大學動物管理制度和使用委員會批準而進行，實驗過程中動物的處理均嚴格按照國際道德準則和國家健康指南關于維護和使用實驗動物先關條例進行（倫理審批號：28392-01）。

1.1.2 藥物 銀杏葉注射液（悅康藥業集團有限公司，國藥準字H20070226）

1.1.3 試劑及儀器 主要試劑：PMSF（貨號：283922）、SDS-PAGE電泳膠（貨號：22934）、BCA工作液（貨號：22228）、聚丙烯酰胺凝膠（貨號：39123），以上試劑購于碧云天公司;DAPI染色液（貨號：K9787）、SIRT1（貨號：8469s）、NF-κB（貨號：8242s）、IκB-α（貨號：4814s）、Bcl-2（貨號：15071s）、Bax（貨號：89477s）、Caspase-3（貨號：9662s）、Iba1（貨號：17198s）、β-actin（貨號：3700s），以上購于美國CST公司。IL-6（貨號：83932）、IL-8（貨號：37483）、TNF-α（貨號：18293）、SOD（貨號：28322）、MDA ELISA試劑盒（貨號：83724），以上購于艾美捷科技有限公司。主要儀器：水迷宮分析系統（諾達思，型號：RT1908B），激光共聚焦熒光顯微鏡（Bio-rad，美國，型號：TE300），酶標儀（Leica，德國，型號：200 PRO），凝膠成像系統（Bio-rad，美國，型號：ChemiDoc XRS+）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將75只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、造模+銀杏提取物（銀杏葉）組、造模+銀杏提取物+抑制劑（抑制劑）組、造模+銀杏提取物+激動劑（激動劑）組，每組15只。模型組、銀杏葉組、抑制劑組、激動劑組大鼠均經腹腔注射丙泊酚（100 mg/kg）進行麻醉。

1.2.2 干預方法 銀杏葉組、抑制劑組、激動劑組從麻醉前3 d腹腔注射銀杏葉注射液（2 mL/kg），1次/d，連續給藥3 d;抑制劑組大鼠在丙泊酚麻醉前腹腔注射EX527（5 mg/kg，EX527用DMSO溶解，生理鹽水稀釋）;激動劑組大鼠在丙泊酚麻醉前腹腔注射SRT1720（200 mg/kg，SRT1720用DMSO溶解，生理鹽水稀釋）。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 認知行為學檢測 麻醉后第2天行水迷宮試驗：1）定位航行測試：大鼠面向池壁4象限入水點入水，記錄大鼠2 min尋找平臺時間（逃避潛伏期），每天上午、下午各檢測1次，持續3 d;2）空間探索測試：麻醉后第4天，隨機選取入水點，記錄2 min內穿越原平臺次數。

1.2.3.2 蘇木素-伊紅染色（HE染色）觀察大鼠腦組織神經元形態學變化 每組取4只大鼠麻醉后經4%多聚甲醛溶液灌注固定后取腦。常規脫水、包埋、切片（厚5 μm）、烘片、脫蠟。將切片放入蘇木素溶液中染色3 min后，酸水及氨水中，各10～20 s用以分色;最后放入乙醇伊紅溶液染色3 min;水洗后，置于梯度乙醇溶液中分別脫水5 min，透明、分片。采用光學顯微鏡（×400）觀察海馬組織的形態學特征。

1.2.3.3 透射電鏡觀察腦組織超微結構 每組大鼠隨機選取6只大鼠，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，用鋒利手術刀于冰山快速取下腦組織，將樣本置于3%戊二醛→1.5%多聚甲醛→0.1 mol/L PBS進行前固定，隨后再用0.1 mol/L PBS漂洗3次，15 s/次，再將樣本置于1%鋨酸-1.5亞鐵氰化溶液中4 ℃環境下固定2 h，再用0.1 mol/L PBS漂洗3次，15 s/次，70%乙醇（10 min）→80%乙醇（10 min）→90%乙醇（10 min）→95%乙醇（10 min）→無水乙醇（10 min）脫水后將樣本置于包埋劑中35 ℃（12 h）→35 ℃（24 h）→45 ℃（12 h）→60 ℃（60 h）進行包埋聚合，超薄切片后用醋酸鈾染色30 min，蒸餾水漂洗3次，20 s/次，再用檸檬酸鉛染色5 min后再用蒸餾水漂洗3次，20 s/次，置于透射電鏡下觀察拍照。

1.2.3.4 免疫熒光染色法檢測腦組織小膠質細胞標志物Iba-1表達 常規石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復（100 μL/樣本）;內源性過氧化物酶阻斷劑消除過氧化物酶的活性（100 μL/樣本），室溫孵育10 min;加入非特異染色阻斷劑（100 μL/樣本），室溫孵育10 min;除去非特異染色阻斷劑，加入Iba1一抗工作液（100 μL/樣本），37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜;PBS漂洗后加入相應的熒光二抗37 ℃反應1 h;PBS漂洗后甘油封片，熒光及激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果以Iba1陽性細胞率表示：Iba1陽性細胞數/總的細胞數×100%。

1.2.3.5 采用雙抗體/夾心酶聯免疫吸附測定（ELISA）測定IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、MDA水平?? 采用雙抗體/夾心酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法檢測腦組織勻漿IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、MDA的含量，嚴各指標格按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀讀取結果并統計分析。

1.2.3.6 Western blot檢測腦組織SIRT1、NF-κB、IκB-α、Bcl-2、Bax蛋白表達量 干預后每組隨機取5只大鼠，用水合氯醛以3 mL/kg的比例進行麻醉，冰上迅速于冰山快速取下腦組織，將樣本置于含1%PMSF的蛋白裂解液中充分裂解，裂解后置于離心機中分離上清與沉淀，提取上清，用BCA法進行蛋白測定并計算上樣量，隨后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，再將凝膠上的蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，隨后在室溫條件下的封閉液中振搖1.5 h進行封閉。將SIRT1、NF-κB、IκBα、Bcl-2、Bax以及β-actin一抗按比例稀釋后，將膜放置于4 ℃孵育過夜，次日用TBST液漂洗，每次搖床漂洗10 min，3次后相應加入按比例稀釋好的二抗中，室溫孵育2 h，再次用TBST漂洗3次，隨后用顯影液進行發光顯色，并用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進行灰度分析，測定條帶吸光度，將目的條帶與內參條帶的灰度值進行比較，二者比值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.3.7 免疫熒光染色法檢測腦組織Caspase-3水平變化 常規石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復（100 μL樣本）;內源性過氧化物酶阻斷劑消除過氧化物酶的活性（100 μL/樣本），室溫孵育10 min;加入非特異染色阻斷劑（100 μL/樣本），室溫孵育10 min;除去非特異染色阻斷劑，加入Caspase-3一抗工作液（100 μL/樣本），37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜;PBS漂洗后加入相應的熒光二抗37 ℃反應1 h;PBS漂洗后甘油封片，熒光及激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果以Iba1陽性細胞率表示：Iba1陽性細胞數/總的細胞數×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，數據以均值±標準差（±s）表示。數據符合正態分布，采用單因素方差分析;數據不符合正態分布，采用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分的比較 術后第2天，與對照組比較，其余4組大鼠逃避潛伏期均升高（P<0.05），且4組間差異無統計意義（P>0.05）;術后第3天及第4天，各組逃避潛伏期的時間均較前有所下降，但銀杏葉組和激動劑組的逃避潛伏期的時間較模型組和抑制劑組短（P<0.05），且銀杏葉組和激動劑組穿越平臺次數亦較模型組和抑制劑組多（P<0.05）;與銀杏葉組比較，激動劑組逃避潛伏期的時間較短，穿越平臺次數較多（P<0.05）;與抑制劑組比較，模型組潛伏期的時間較長，穿越平臺次數較少（P<0.05）。見表1、表2。

2.2 各組大鼠腦組織神經元形態學變化的比較?? HE染色觀察腦組織神經元形態學變化。結果顯示，對照組大鼠腦神經元細胞排列整齊、形態規則，細胞核大小形態正常，細胞質豐富，未見膠質細胞增生;模型組組和抑制劑組可見大量神經元細胞排列疏松，細胞核固縮且形態不規則，細胞質稀少，胞核與胞質界限模糊，見膠質細胞增生增多;銀杏葉組和激動劑組見少部分排列紊亂神經元細胞，少量細胞核固縮深染、細胞質減少，膠質細胞增生不多。見圖1。

2.3 各組大鼠腦組織超微結構變化的比較 電鏡觀察銀杏葉注射液對大鼠腦組織突觸形態的影響，結果顯示：與模型組、抑制劑組比較，銀杏葉組和激動劑組腦組織突觸的結構較完整，數量明顯增多（P<0.05）;且激動劑組突觸數量較銀杏葉組多（P<0.05），抑制劑組突觸數量較模型組多（P<0.05）。見圖2、表3。

2.4 各組大鼠腦組織Iba1表達的比較

免疫熒光觀察銀杏葉注射液對大鼠腦組織小膠質細胞活化的影響，結果顯示：與模型組、抑制劑組比較，銀杏葉組和激動劑組腦組織小膠質細胞活化數量較少（P<0.05）;且激動劑組小膠質細胞活化數量較銀杏葉組少（P<0.05）;抑制劑組小膠質細胞活化數量較模型組少（P<0.05）。見圖3、表4。

2.5 各組大鼠腦組織IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、MDA表達的比較 ELISA檢測了腦組織勻漿液IL-6、IL-8及TNF-α水平、SOD活性及MDA水平。如圖3結果顯示，與模型組、抑制劑組比較，銀杏葉組和激動劑組海馬區SOD活性升高、MDA活性降低、IL-6、IL-8、TNF-α含量明顯降低（P<0.05）;與激動劑組比較，銀杏葉組SOD活性降低、MDA、IL-6、IL-8及TNF-α含量明顯升高（P<0.05）;與抑制劑組比較，模型組SOD活性降低、MDA、IL-6、IL-8及TNF-α含量升高（P<0.05）。見表5。

2.6 各組大鼠腦組織中SIRT1/NF-κB信號通路關鍵蛋白表達的比較 Western blot法檢測了腦組織SIRT1、NF-κB、IκB-α、Bcl-2、Bax蛋白水平，免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達。結果顯示，與模型組、抑制劑組比較，銀杏葉組和激動劑組海馬區SIRT1、IκB-α、Bcl-2蛋白表達升高，IκB-α、Bax、Caspase-3蛋白表達降低（P<0.05）;與激動劑組比較，銀杏葉組SIRT1、IκB-α、Bcl-2蛋白表達降低、IκB-α、Bax、Caspase-3蛋白表達升高（P<0.05）;與抑制劑組比較，模型組SIRT1蛋白表達下降，IκB-α、Bax、Caspase-3蛋白表達升高（P<0.05）。見圖4、表6、圖5、表7。

3 討論

有研究顯示麻醉藥品可導致小膠質細胞的大量活化，從而誘發細胞內Ca2+超載、炎性反應遞質釋放增多、活化氧（SOD、MDA）活性增加，由此加重炎性反應和氧化應激反應程度[8-9]。此外，隨著神經元受損時間的延長，機體瀑布式炎性反應級聯反應被激活，進一步導致炎性反應因子（IL-6、IL-8、TNF-α等）、活性氧及各類活性酶的釋放，TNF-α是重要的促炎因子，可啟動炎性反應細胞因子活性，IL-6廣泛參與免疫應答和炎性反應調控，是招募炎性反應細胞、放大炎性反應的重要因子之一。長此以往，腦組織尤其是海馬組織的神經元細胞破壞明顯，細胞間緊密連接物質大量流失，腦區功能逐漸受損，最終導致認知障礙[10-12]。NF-κB是炎性反應通路中重要的中轉轉錄因子，活性氧濃度的增加可促使IκB發生磷酸化，由此對NF-κB的抑制作用被削弱，隨后NF-κB移位至細胞核，激活了其轉錄過程，促進了其他炎性反應細胞及因子（單核細胞、中性粒細胞、IL-6、TNF-α等）、COX-2、趨化因子及黏附分子等的表達，加劇了炎性反應浸潤程度，誘導神經元凋亡[13-14]。據研究可知SIRT1是NF-κB主要調控蛋白，一旦SIRT1被激活，可與p65亞基上Lys310殘基產生結合效應，從而促使NF-κB發生去乙酰膽堿化蛋白修飾，導致活性消失，其誘導的炎性反應及氧化應激反應隨之減輕。超氧化物歧化酶（SOD）是中樞系統重要的抗氧化酶之一，丙二醛（MDA）是自由基作用于細胞膜磷脂發生過氧化反應的產物，故SOD和MDA聯合檢測被認為可準確反映腦組織氧化應激狀態。本研究我們發現與空白組比較，POCD模型制備的大鼠海馬組織的神經元細胞排列紊亂，密度減低，這提示POCD與海馬組織的病理變化確實存在密切關系。我們通過TUNNEL檢測發現POCD神經元細胞凋亡率明顯升高，這揭示POCD發生發展過程中神經元細胞確實發生了過度凋亡，Bcl-2家族在細胞凋亡中占據重要位置，Bcl-2和Bax的表達濃度決定細胞的轉歸，Bcl-2表達占優勢時抑制細胞凋亡，反之，當Bax表達占優勢時促進細胞凋亡，在本研究中我們通過ELISA證實POCD模型鼠Bcl-2/Bax比值下調，這說明Bcl-2/Bax均參與調控POCD模型的神經元細胞凋亡過程。于此同時我們還證實POCD模型鼠SIRT1、IκBα表達下降，NF-κB、SOD、MDA表達上調，外周血IL-6、IL-8、TNF-α的濃度增加。上述指標的變化提示丙泊酚誘導麻醉導致POCD可激活NF-κB表達，增強炎性反應，加重神經元損傷，誘導海馬神經元細胞凋亡。

早在《本草綱目》時期即已記載銀杏葉可防病、治病，但具體資料偏少。直至20世紀60年代，大量研究人員通過臨床及藥理研究[15-16]證實銀杏葉可作為法定藥材，其性味甘、苦、澀、平，具有活血化瘀通絡，化濁降脂之功。藥理研究人員發現銀杏葉伴有20余種黃酮類成分，可明顯改善機體血液流變學、血脂代謝等，是迄今為止被認為可有效改善認知的中醫藥材之一[17-18]。本研究利用銀杏葉注射液對POCD模型進行干預，結果顯示銀杏葉注射液確對海馬組織有明顯保護效應，可修復海馬組織的病理改變，改善神經元細胞的形態，同時抑制機體炎性反應及氧化應激反應，與此同時我們發現干預后SIRT1、IκBα、Bcl-2濃度上調，NF-κB、Bax含量減少，神經元細胞凋亡率下降，說明銀杏葉注射液有效抑制了模型鼠海馬神經元細胞的凋亡，為POCD病情的改善提供了條件。在進一步的機制研究中我們發現側腦室注射SIRT1/NF-κB通路的抑制劑和激動劑對銀杏葉注射液改善模型鼠認知能力亦存在明顯的影響，這進一步證實銀杏葉注射液有效治療POCD的作用機制是通過SIRT1/NF-κB信號通路實現的。

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（2020-08-14收稿 責任編輯：王明）