急性乙型肝炎患者pDCs上CD86表達變化及意義

王曉玲，沈麗賢，李惠文，張亞芹，李 瑤，吳書娜

(河北中醫肝病醫院 二病區，河北 石家莊 050800)

據世界衛生組織(WHO)統計，全球約有3.5億慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者，大大增加了肝硬化和肝癌的發生概率。人體的免疫反應與HBV的相互作用對宿主的臨床結局起著決定性作用，病毒清除需要輔助性T細胞(T helper,Th)和細胞毒性淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的激活，發揮有效作用。有學者認為，HBV-特異性T細胞的功能缺陷讓HBV感染慢性化[1]，其功能缺陷的原因仍不是很清楚。作為重要的抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APC)，樹突狀細胞(dendritic cells,DC)能有效激活T細胞反應，對臨床結局起重要作用，尤其是HBV感染初期[2-4]。DC分為髓樣DC(mDC)和漿細胞樣DC(pDC)：mDC主要發揮抗原提呈作用；pDC則可以產生大量Ⅰ型干擾素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)，協助激活固有免疫反應和適應性免疫反應，在抗HBV免疫反應中起著中樞性的作用[5-7]。外周血pDCs在慢性乙型肝炎(chornic hepatitis B,CHB)患者中雖然數量沒有改變，但表型和功能均有受損[8]。有關pDCs在急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)患者中的變化及作用研究較少，其具體作用機制尚不清楚。DC 細胞在外周血淋巴細胞中所占的比例很小，其發揮免疫作用主要是通過分泌Ⅰ型干擾素或細胞因子，DC 在適應性免疫過程中作為抗原提呈細胞，活化 T淋巴細胞參與抗病毒過程。DC與NK細胞之間還同時存在相互作用[9]，即NK細胞調節 DC的分化方向，DC分泌細胞因子促進NK細胞活化。本研究納入AHB患者40例，采用酶聯免疫方法及細胞流式技術進行研究，旨在探討pDCs在AHB患者臨床轉歸中的變化及作用，現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 2015年6月-2017年5月于醫院就診的急性乙型肝炎(AHB)患者40例，男12例，女28例，年齡21～71歲，平均(59.5±7.1)歲。①診斷標準：參考《病毒性肝炎防治方案》[7]，患者感染HBV前(>6月)無乙型肝炎病史，感染后出現AHB臨床癥狀，HBsAg陽性、HBV-DNA陽性、HBc-IgM陽性、肝功能異常。②納入標準：患者年齡18～75歲，性別不限，診斷符合AHB診斷標準，首次確診病例，未接受過抗病毒藥物治療及免疫治療，患者依從性好，能完成相關檢查。③排除標準：年齡<18歲或>75歲，合并其他病毒性肝炎，HIV感染，藥物性、酒精性及自身免疫性肝炎，合并其他系統器官嚴重疾病，合并腫瘤、免疫相關疾病等，合并精神疾病或癲癇，妊娠期或哺乳期女性，依從性差，不能完成全部檢查項目。另納入基線資料匹配的同期健康體檢者26例為健康對照組(health control,HC)，其中男6例，女20例，年齡24～71歲，平均(55.2±6.3)歲。2組受試者性別、年齡等基本臨床資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，全部受試者均知情同意并簽署知情書。

1.2治療方法 AHB患者入院確診后均囑其充分休息、合理飲食、適當增加營養，并根據病情給予退黃、降酶、保肝等對癥治療，改善肝臟微循環，促肝細胞生長素治療，部分患者給予人血白蛋白注射液等對癥支持處理，預防患者病情重癥化或慢性化，綜合病情給予核苷類似物，全部患者應用恩替卡韋分散片(江蘇正大天晴藥業股份有限公司生產)0.5 mg空腹口服，1次/d。

1.3檢測指標與方法 健康體檢者在體檢當日清晨、AHB患者在住院次日及治療6周后清晨空腹抽取靜脈血5 ml,應用貝克曼庫爾特離心機以2 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱保存待測，由檢驗科醫師按試劑盒操作說明書進行各項指標檢測。

1.3.1HBV DNA、HBsAg、HBeAg及肝功能檢測 取血液標本2 ml，HBV DNA定量檢測采用熒光定量PCR法，在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,再通過標準曲線對未知模板進行定量分析，試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。HBsAg、HbeAg等乙型肝炎標志物采用電化學發光法(ECL)進行定量檢測，HBsAg正常參考值0～0.08 IU/ml,HbeAg正常參考值0～1 S/CO，試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，應用Elec-sys2010電化學發光免疫分析儀進行檢測。并根據治療前后檢測結果計算HBV DNA轉陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學轉換率。

1.3.2外周血pDCs檢測 取血樣標本200 μl分別加入Lin1-FITC 3 μl，HLA-DR-PerCP 3 μl，CD123-APC 3 μl，CD86-PE 5 μl，室溫避光染色，加入紅細胞裂解液，應用PBS緩沖液洗滌細胞2次，參照試劑盒說明書加入熒光標記的相應抗體(均購自美國RD公司)，避光結合30 min后，置于冰上待檢。使用MDL-Flow流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司生產)完成檢測，利用微球定量，根據流式細胞儀測定時制作的標準曲線，計算出pDCs表面CD86分子的絕對計數(CD86ABC)。全部過程嚴格按照試劑盒說明進行操作。

2 結 果

2.1AHB患者治療前后肝功能指標比較 治療6周后，AHB患者肝功能指標明顯改善，與治療前比較，差異均有統計學意義(P均<0.01),見表1。

表1 AHB患者治療前后肝功能指標比較

2.2AHB患者治療前后乙型肝炎標志物水平比較 治療6周后，AHB患者乙型肝炎標志物水平明顯下降，與治療前比較，差異均有統計學意義(P<0.01),見表2。

表2 AHB患者治療前后乙型肝炎標志物水平比較

2.3HBV DNA轉陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學轉換率變化 治療6周后，AHB患者HBV DNA轉陰率為82.5%，HBsAg清除率為72.5%，HBeAg血清學轉換率為75.0%，與治療前比較，差異均有統計學意義(P<0.01),見表3。

2.4外周血pDCs頻數比較 治療前HC組與AHB組外周血單個核細胞(PBMC)比較差異無統計學意義，而AHB組治療后PBMC頻數顯著低于治療前。HC組外周血pDCs頻數顯著高于AHB組治療前，而AHB組治療后與治療前pDCs頻數比較差異無統計學意義，見圖1。

表3 AHB患者治療后HBV DNA轉陰率、HBsAg清除率、HBeAg血清學轉換率比較[例(%)]

2.5CD86+pDCs頻數比較 治療前HC組與AHB組CD86+pDCs頻數比較，差異無統計學意義，AHB組治療后CD86+pDCs頻數顯著高于治療前。HC組CD86ABC顯著低于AHB組治療前，而AHB組治療后與治療前CD86ABC差異無統計學意義，見圖2。

3 討 論

急性乙型肝炎多數呈自限性過程，預后一般良好，臨床上一般無需抗病毒治療，但仍有 5%～10%的患者會發展為慢性乙型肝炎，導致病情遷延，影響患者預后。因此對可能會演變為慢性乙型肝炎的AHB患者應及時進行抗病毒及免疫調節治療，以減少其轉變為慢性肝炎[10-11]。另有研究表明，對于少數急性乙型肝炎患者，經相應治療后肝功能正常或基本正常，HBV DNA或HBsAg滴度降低，或者行肝組織病理檢查發現病變時，還應積極進行干擾素或胸腺肽治療，以清除病毒，加快乙型肝炎標志物的血清學轉換[12-13]。本研究中，AHB患者治療6周后 HBV DNA轉陰率為82.5%，HBsAg清除率為72.5%，HBeAg血清學轉換率為75.0%，均取得了較好的療效。

在慢性HBV感染患者，免疫控制對病毒的清除至關重要，但HBV也進化出了相應的機制去逃避免疫系統的清除。HBV雖然激活了人體的免疫系統，但可以逃避甚至破壞人體免疫系統，具體機制尚不十分明確。受多種因素影響，不同HBV感染者的臨床結局往往不同[14-15]。在眾多參與抗HBV免疫反應細胞里，pDCs發揮著中樞性的作用。pDCs可以通過TLRs(Toll like receptors)直接識別HBV的核酸、單鏈RNA以及未甲基化的DNA。TLRs(TLR7和TLR9)一經觸發，pDCs不但能快速、大量的產生IFN-Ⅰ，而且可以產生其他的細胞因子如TNF-α(tumor necrosis factor)、IL-6(interleukin)以及細胞表面共刺激分子[16-17]。這些細胞因子即可以直接抑制HBV的復制，而且還可以激活自然殺傷(NK)細胞及T細胞，激活和調控抗病毒免疫，間接發揮清除HBV的作用。另外，pDCs還可以直接從被感染的細胞中識別和提成HBV抗原[18-19]。

國內外多項基礎研究對DC在乙型肝炎動物模型中的作用及可能機制進行了分析探討，但目前臨床應用還較少，這是由于此類治療方法尚不能達到預期的清除病毒療效，還有學者研究發現，IL-18具有刺激Thl細胞分泌產生IFN-1及IL-2的功能，進而提高患者細胞免疫功能，因此可能具有增強DC治療乙型肝炎療效的作用，但目前僅為臨床前期研究[20-21]，進一步相關機制及具體療效尚需后期開展大規模臨床試驗來驗證。

在慢性HBV感染患者，外周血pDCs數量沒有變化，似乎不受HBV影響，但發現其功能包括分泌IFN-α的能力受損[22]。但也有研究發現，HBV攜帶者mDC和pDCs的頻數和功能無論在體內還是體外均未改變。大多數學者認為，HBV不直接影響pDCs。我們的研究發現，與健康對照相比，在急性乙型肝炎患者pDCs的頻數降低，且在治療后第6周無明顯變化。產生這種現象的原因可能為pDCs在慢性HBV感染患者被抑制，并沒有發揮相應的作用，數量未出現明顯改變。而在急性乙型肝炎患者外周血pDCs發揮重要作用，大量pDCs被招募到肝臟參與炎癥反應，出現歸巢現象[23]，導致外周血pDCs下降，且在治療后一定時間內仍在肝臟聚集。pDCs表面的共刺激分子CD86與T細胞表面的CD28結合后可協同刺激T細胞活化，有助于HBV的清除[24]。相對于非活動HBsAg攜帶者，慢性HBV感染免疫耐受期患者pDCs表面CD86+表達顯著下調[25]，間接說明HBV感染的慢性化的原因可能為pDCs功能受損導致。DC的免疫功能取決于其免疫狀態，其表面CD83、CD86等免疫分子的表達水平低下或缺失將導致DC免疫功能低下或無免疫作用。乙型肝炎病毒及其蛋白可抑制pDC功能，經抗病毒治療后，雖然DC細胞絕對數(CD86ABC)無顯著變化，但具有刺激功能的CD86+pDC頻數顯著增加，表明pDC功能有所恢復[26]。本研究發現急性乙型肝炎患者發病初期pDCs表面CD86+的表達上調，且在治療后仍持續高水平表達。而在治療過程中CD86+pDCs的數量明顯增加，提示CD86+pDCs可能在清除HBV過程中發揮重要作用。

總之，pDCs發揮有效的抗病毒作用是清除HBV的關鍵，而急性乙型肝炎與慢性乙型肝炎患者pDCs功能不同的原因，亦或說是pDCs的功能的不同決定了HBV感染的急性清除或慢性攜帶，其具體機制仍需進一步探討。