miRNA-141在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及其與預后的關系

穆孝慧,艾麗梅

(錦州醫科大學附屬第一醫院 血液科，遼寧 錦州 121000)

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)亞型，約占30%～40%[1]，根據其基因的異質性,可將DLBCL分為3種主要的分子亞型:生發中心B細胞型(germinal center B-cell Like,GCB)、活化B細胞型(activated B-cell like,ABC) 以及第3型(type3)；其中ABC亞型和 type3 預后相似且明顯差于 GCB 亞型，故把它們統一歸為非生發中心亞型(non-GCB)[2]。目前DLBCL的標準治療方案是以R-CHOP為基礎的免疫化療，利妥昔單抗的出現使DLBCL治愈率有了一定的提高,但仍有約40%的患者治療早期即出現耐藥或達到緩解后復發[3]，而這些難治性或復發的患者預后較差。

MicroRNA(miRNA)是一種長度較小的非編碼RNA[4]，在調控中發揮著重要的作用。miRNA表達水平的增高或下降可能導致多種惡性腫瘤的發生及發展，如在某些惡性腫瘤中，miRNA可能扮演著類癌基因或抑癌基因的作用[5]。miRNA-141是近年來發現的可能具有抑制腫瘤功能的一種miRNA，已有研究實驗表明直腸癌患者的病理組織中的miRNA-141的表達水平均較正常者顯著降低[6]。本實驗旨在探討miRNA-141在DLBCL中的表達及其與預后的關系，以對DLBCL患者日后的診斷及預后評估提供更多的選擇。

1 資料與方法

1.1病例選擇 錦州醫科大學附屬第一醫院2017年1月-2019年12月收治的DLBCL患者初始治療前的石蠟包埋組織標本，均經活檢病理學和免疫組織化學分析明確診斷。并在每位入選患者知情的情況下進行隨訪，得到有詳細資料的樣本共40例。同時收集性別、年齡相匹配的20例淋巴結反應性增生患者的石蠟組織標本作為健康對照。4%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，全部重新制作蘇木精伊紅(HE)切片。見表1。

表1 40例DLBCL患者臨床資料

1.2隨訪情況 隨訪日期截至2020年1月1日，隨訪時間1～35個月；隨訪內容主要包括年齡、性別、LDH水平、臨床分期、IPI 評分、總生存期(OS)。OS的計算是從診斷確立到淋巴瘤引起的死亡,或隨訪的終止,以及與本病不相關的死亡算為截尾。前兩年每半年隨訪1次，以后每年隨訪1次直至失訪或死亡。在達完全緩解后仍接受標準的化療方案。

本組40例患者，隨訪時間1～35個月，平均隨訪時間19.2個月，中位隨訪時間為19個月，死亡18例(45.0%)。40例DLBCL患者的2年總生存率為61.8%。

1.3總RNA的制備 使用天根公司石蠟包埋組織切片miRNA提取試劑盒(DP502)提取石蠟切片組織中的總RNA，使用核酸濃度測定儀檢測總RNA的濃度和純度，已制備的總RNA置于-80 ℃保存備用。

1.4RNA逆轉錄及實時聚合酶鏈反應(real-time PCR，RT-PCR) ①cDNA制備：使用天根公司試劑盒miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒 (KR211)進行操作。冰上配置如下反應液(表2)，合成cDNA,反應條件：42 ℃ 60 min；95 ℃ 3 min。②RT-PCR反應：使用miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green) (FP411)試劑盒進行RT-PCR。室溫融化cDNA模板、上游引物(表3)、2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上。使用ABI公司PRISM 7300/7500系列RT-PCR儀進行RT-PCR擴增(表4)，反應條件為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40個循環。反應結束由計算機自動計算各反應管Ct值。實驗重復3次，取平均值。以U6為內參，所測定的miR-141的相對表達量為2-ΔCT，△CT= CTmiRNA-141-CTU6。

表2 反應液體系

表3 miR-141上游、下游及擴增引物序列

表4 RT-PCR反應體系

2 結 果

2.1miRNA-141表達比較 miRNA-141在DLBCL組中的相對表達量為(2.64±1.21)×10-2，在RHL組中為(11.86±1.25)×10-2，miRNA-141在DLBCL組中的表達低于對照組(P<0.01，圖1)。

2.2miRNA-141表達與臨床因素的關系 miRNA-141相對表達量在GCB和non-GCB型DLBCL中表達差異無統計學意義；miRNA-141在DLBCL中的表達與Ann Arbor分期、國際預后指數、血清LDH水平均無明顯的相關性(P>0.05)，見表5。

2.3miR-141在DLBCL中的預后分析 40例DLBCL患者的2年總體生存率為61.8%(圖2)。以miRNA-141相對表達量的中位數為分隔點，高于中位數為高表達組，低于中位數為低表達組。miRNA-141高表達組的2年OS為92.2%，低表達組為26.2%。兩組的OS差異有統計學意義(P=0.001，圖3)。單因素分析，血清LDH≥250 IU/L，IPI≥3分,miRNA-141相對表達量<中位數均與不良預后相關。多因素COX分析，miRNA-141低表達、IPI>3分為均為各自獨立不良預后因素(表6)。推測miRNA-141的相對表達量是預測DLBCL的一項獨立預后指標。

表5 DLBCL中miRNA-141表達與臨床因素的關系

圖3 DLBCL中miRNA-141高表達組的總體生存率高于低表達組(P=0.001)

表6 miRNA-141的表達與相關影響因素的 Cox 回歸分析

3 討 論

近年來非霍奇金淋巴瘤的發病率呈上升趨勢，彌漫大B細胞淋巴瘤更是其中的主要類型，其作為一種侵襲性淋巴瘤，患者的預后情況也是各不相同的，目前IPI評分是國際上通用的用于預測DLBCL患者預后情況的一項評分指標[7]。在治療方面，利妥昔單抗聯合化療雖獲得了明顯療效,但目前仍有一部分患者為復發難治型，二線治療手段有限，且治療效果并不理想[8]。已有大量研究發現在DLBCL的發生及發展過程中存在著miRNA的異常表達：如在DLBCL患者中miRNA-155-5p和miRNA-21-5p的表達上調[9]，而miRNA-224的表達水平顯著降低(P<0.05)[10]。此外，有研究發現miRNA-28-5p、miRNA-214-5p、miRNA-339-3p和miRNA-5586-5p的高表達與較好的預后相關，而miRNA-324-5p的高表達提示預后不良[11]。同時有報道發現異常表達的miRNA與DLBCL的不良治療反應相關：如miRNA-17/92簇、miRNA-224和miRNA-146b-5p在預測DLBCL化療反應方面有著一定的價值[12]；miRNA-125b和miRNA-130a與DLBCL患者發生化學耐藥風險相關，且參與了DLBCL患者的復發和疾病進展過程[13]。

miRNA-141在多種腫瘤中表達下降，推斷其有抑癌作用。在大腸癌中,miRNA-141可抑制癌細胞的生長[14]。另外miRNA-141在肝癌組織中表達下降[15]；還有研究結果表明，miRNA-141在人乳腺癌細胞及胃癌細胞中起到抗腫瘤的作用，可以作為潛在的治療靶點[16-17]。在血液系統惡性疾病中，有研究表明miRNA-141在B細胞急性淋巴白血病(ALL)患兒中的表達明顯降低[18]。

本研究得出結論，DLBCL患者的病理組織中的miRNA-141 的表達水平低于淋巴結反應性增生組，推測在DLBCL中miRNA-141可能發揮著抑癌作用，這為疾病的治療也提供了一個新的可能的輔助診斷指標及治療靶點；另外通過統計分析，miRNA-141的相對表達量與患者的發病年齡、血清LDH水平、免疫亞型及疾病分期均無明顯相關性(P>0.05)。在DLBCL患者中，單因素分析，血清LDH≥250 IU/L，IPI≥3分,miRNA-141相對表達量3分別為均為各自獨立不良預后因素。此外，miRNA-141高表達組的2年OS為92.2%，低表達組則為26.2%，高表達組的OS明顯高于低表達組，OS有顯著的差異(P<0.01)，推斷miRNA-141的表達水平可能是判定預后的另一項重要獨立指標。關于miRNA-141是如何在DLBCL中實現抑癌作用，查閱文獻發現在胃癌細胞中上調miR-141可以抑制阻斷磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路[19]，另有研究發現[20]肝癌中circRNA-100338/miR-141-3p軸參與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路。同時有研究發現在DLBCL的發生發展中有PI3K/AKT信號傳導通路的異常表達[21]。綜上，推測miRNA-141是通過阻斷PI3K/AKT信號通路在DLBCL患者中起到抑癌基因的作用，但仍需要進一步的實驗去證實這一觀點。

本研究探討了miRNA-141在DLBCL中的表達情況，發現miRNA-141在DLBCL中的表達降低，而且miRNA-141高表達組的預后明顯好于低表達組。該研究可以為DLBCL的診斷、治療及預后分析提供一定的參考意義。