替普瑞酮對百草枯誘導的SH-SY5Y細胞TDP43蛋白異常聚集抑制作用的研究

(青島大學附屬醫院神經內科，山東 青島 266003)

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種致命的神經退行性疾病。其特征是運動神經元的快速進行性退化和隨后的四肢肌肉萎縮，約5%～10%的ALS為家族性[1]。目前FDA批準治療ALS的藥物主要有利魯唑(谷氨酸抑制劑)與依達拉奉，但其作用機制尚不完全清楚且療效有限[2]。TDP43是主要定位于細胞核內的一種DNA及RNA結合蛋白，參與調節RNA轉錄和選擇性剪接[3-4]。但在ALS中異常的TDP43蛋白游離于細胞核外，導致細胞質中的異常TDP43蛋白聚集，增加了細胞毒性[5-6]。已有證據表明清除異常TDP43蛋白已成為治療ALS的一種有效方法[7-8]。替普瑞酮(GGA)是一種無毒的熱休克誘導劑，有證據表明GGA可以有效通過血腦屏障從而對大腦和脊髓神經元發揮保護作用[9-10]。最近的研究表明，APP23轉基因阿爾茨海默病模型小鼠通過灌胃GGA，不僅改善了認知功能，而且降低了腦組織中Aβ蛋白表達水平，并且抑制了Aβ斑塊沉積[11]。可見GGA對神經退行性疾病具有一定的治療潛力。百草枯(PQ)誘導SH-SY5Y細胞氧化應激損傷常用于模擬ALS疾病的發展過程[12-13]。因此，本研究利用PQ誘導SH-SY5Y細胞作為氧化應激模型，研究GGA對異常TDP43蛋白聚集的抑制作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細胞系由中國科學院上海細胞庫提供。GGA為美國MCE公司產品。PQ為美國Sigma公司產品。DMEM培養基為美國Gibco公司產品。胎牛血清為美國BI公司產品。所有抗體均為美國Cell Signaling Technology公司產品。MTT試劑盒和Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒為索萊寶生物科技有限公司產品。

1.2 細胞模型的制備及細胞免疫熒光化學染色檢測細胞內TDP43

SH-SY5Y細胞株培養于含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養。以1 mmol/L PQ處理培養24 h的SH-SY5Y細胞制備氧化應激模型(模型組)，以沒有經任何處理的細胞為對照組，并通過細胞免疫熒光化學染色技術分別檢測模型組和對照組細胞內TDP43的表達情況。染色步驟按照說明書操作。

1.3 MTT比色法檢測SH-SY5Y細胞存活率

將研究分為無任何處理SH-SY5Y細胞組(A組)、以100 μmol/L的GGA處理SH-SY5Y細胞24 h組(B組)及以0、20、50、100 μmol/L的GGA處理氧化應激模型細胞24 h組(C～F組)。將各組舊培養液吸出，再每孔加入MTT 20 μL繼續避光培養4 h，棄上清液，不沖洗加入DMSO 150 μL充分溶解甲瓚結晶，37 ℃孵育30 min，酶標儀測定490 nm波長處的吸光度(A)值，計算各組的細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A值÷對照組A值)×100%。

1.4 流式細胞儀檢測SH-SY5Y細胞凋亡情況

將A～F組的SH-SY5Y細胞以不含EDTA的胰酶消化后，室溫以1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預冷后PBS重懸細胞，再次以1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入Binding Buffer 100 μL重懸細胞后，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫下避光孵育15 min。上機前加入PI 10 μL進行染色，每組加入PBS 400 μL后上機檢測細胞凋亡率。

1.5 免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中P62、TDP43蛋白表達水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值

將A～F組的SH-SY5Y細胞提取蛋白以后以每孔20 μg蛋白量等質量上樣，以100 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PDVF膜上。以體積分數0.05的脫脂奶粉室溫封閉2 h后再分別加入TDP43抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST清洗PDVF膜3次，每次10 min，后用HRP標記的二抗室溫孵育1 h，ECL發光劑顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析，檢測A～F組細胞的TDP43、P62蛋白表達水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值情況。實驗重復3次，取平均值。

1.6 Western blot檢測3-MA阻斷自噬后細胞中TDP43蛋白表達水平

將研究分為無任何處理SH-SY5Y細胞組(A組)以及以0、50、50 μmol/L的GGA處理氧化應激模型細胞24 h組(G～I組)，其中I組的細胞再以5 mmol/L的3-MA阻斷自噬，自噬強度以LC3BⅡ/Ⅰ比值表示。采用Western blot檢測A、G～I組細胞中TDP43蛋白的表達，并計算LC3BⅡ/Ⅰ比值情況。實驗重復3次，取平均值。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 細胞免疫熒光化學染色檢測細胞模型內TDP43表達情況

細胞免疫熒光化學染色以后對照組SH-SY5Y細胞中TDP43蛋白定位于細胞核內，模型組SH-SY5Y細胞中TDP43蛋白定位于細胞質中(圖1)，圖中紅色箭頭所指為SH-SY5Y細胞質內TDP43蛋白異常聚集體。

圖1 SH-SY5Y細胞質內TDP43蛋白表達情況比較(免疫化學染色，100 μm)

2.2 各組SH-SY5Y細胞存活率和凋亡率比較

A～F組SH-SY5Y細胞存活率與凋亡率比較差異有顯著性(F=37.57、74.10，P<0.01)；其中D、E、F組的細胞存活率和凋亡率與C組比較均有顯著差異(q=4.11～14.24，P<0.01)。見表1。

2.3 各組SH-SY5Y細胞中TDP43、P62蛋白表達水平及LC3BⅡ/Ⅰ比值比較

A～F組SH-SY5Y細胞中TDP43、P62蛋白表達水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值比較差異有顯著性(F=56.68～231.50，P<0.01)；D、E、F組TDP43、P62蛋白表達水平和LC3BⅡ/Ⅰ比值與C組比較比較有顯著差異(q=3.01～22.23，P<0.01)。見表1。

表1 GGA對各組細胞存活率、凋亡率、LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43、P62表達的影響

2.4 3-MA阻斷自噬后各組細胞中TDP43 蛋白與LC3BⅡ/Ⅰ比值情況

A、G～I組細胞中TDP43蛋白表達水平分別為0.97±0.09、1.27±0.03、0.34±0.06、0.87±0.05。A、G～I組細胞當中LC3BⅡ/Ⅰ比值分別為1.03±0.04、1.21±0.03、1.88±0.08、0.57±0.06。A、G～I組TDP43蛋白表達水平與LC3BⅡ/Ⅰ比值比較差異有顯著性(F=40.40，66.68，P<0.01)；I組與H組細胞中LC3BⅡ/Ⅰ比值及TDP43蛋白表達水平比較差異均有顯著性(q=16.02、6.12，P<0.01)。

3 討 論

神經元胞質中異常TDP43蛋白聚集為ALS的關鍵神經病理學特征之一，異常TDP43蛋白聚集干擾神經元正常功能以及其本身具有多種毒性[14-15]，是導致運動神經元進行性丟失的主要原因[16]。近年來，一些能夠減輕異常TDP43蛋白聚集的策略引起了人們廣泛關注。有證據顯示在GFP-TDP-43和GFP-TDP-25轉染SH-SY5Y細胞中阿霉素和秋水仙素能夠顯著清除TDP43蛋白聚集，并認為這兩種藥物可能成為治療ALS的候選用藥[17]。最近研究表明，DJ-1(也稱為PARK7)基因過表達能夠通過抑制異常TDP43蛋白聚集，從而提高PQ誘導的SH-SY5Y細胞存活率[13]。因此抑制異常TDP-43蛋白聚集可能是治療ALS的一種潛在治療策略，這一觀點得到了上述研究的支持。在本研究中，觀察到GGA能夠抑制PQ誘導SH-SY5Y細胞中異常TDP43蛋白聚集。GGA的這種作用表明該化合物可能是治療和預防ALS的潛在候選治療藥物。

自噬是一種降解異常蛋白與受損細胞器的經典途徑，是真核細胞內蛋白穩態系統的重要組成部分。在ALS患者尸檢中發現，異常TDP43蛋白在神經元中無法及時降解而大量蓄積且自噬能力受到不同程度受損，因而自噬功能障礙可能是TDP43蛋白無法降解的原因之一[18]。有證據表明氟桂利嗪、甲氨蝶呤能夠通過增強自噬促進異常TDP43蛋白聚集的清除，從而提高小鼠神經元、人干細胞源性神經元以及攜帶突變的TDP43基因的星形膠質細胞的存活[19]。最近的一項研究顯示，海藻糖通過增強自噬而降低了轉染突變型TDP43基因的SH-SY5Y細胞中異常TDP-43蛋白表達水平[20-21]。雷帕霉素對ALS的細胞模型和動物模型均顯示出保護作用，如改善SQSTM1斑馬魚、ALS-TDP43果蠅模型和TDP43小鼠模型的疾病表型，清除異常TDP43聚集及減少神經元死亡[8]。這些研究表明，通過啟動自噬清除異常TDP43蛋白是治療ALS的一種有效策略。

GGA誘導熱休克相關蛋白的表達是其胃保護作用的重要機制之一[22]。GGA通過抗凋亡和誘導HSP70表達，對脊延髓肌萎縮癥[23]、帕金森病[24]等退行性疾病的動物模型均顯示出改善癥狀的作用。然而重復灌胃GGA的APP23轉基因阿爾茨海默病模型小鼠，其大腦中Aβ蛋白表達水平下降和Aβ斑塊沉積減輕。在APP23轉基因小鼠大腦中并沒有檢測到HSP70蛋白表達水平升高。該研究認為GGA可能是通過非依賴HSP70機制來達到改善效果[25]。同樣在本研究中，GGA能夠減輕PQ誘導的SH-SY5Y氧化應激模型細胞中異常TDP43蛋白聚集，但GGA的具體作用的機制仍不清楚。有證據表明GGA能夠通過誘導保護性自噬，從而減輕脂多糖誘導的腹膜炎大鼠的腹膜炎癥狀[26]。因此，GGA的這種作用可能與自噬有關。本研究結果示，GGA能夠在此模型中促進LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉換，同時減少異常聚集TDP43蛋白表達水平。而當利用3-MA阻斷自噬以后，觀察到GGA降低TDP43蛋白表達水平的能力顯著減弱。這表明GGA可能通過增強自噬促進異常TDP43蛋白的降解，自噬的激活可能是GGA發揮神經保護作用的機制之一。

綜上所述，本研究結果顯示，GGA通過增強自噬抑制PQ誘導的SH-SY5Y氧化應激模型細胞中TDP43蛋白的異常聚集，這可能是GGA抑制異常TDP43蛋白聚集的機制之一。GGA的這種作用為其成為治療ALS的候選藥物提供了參考。