兒童耐氨芐西林流感嗜血桿菌耐藥機制及同源性研究

王姜琳， 孫 杰， 楊慧健， 王冰潔， 潘 芬， 張 泓

（1. 上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040；2. 上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院檢驗科，上海 201800）

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）是一種革蘭陰性桿菌，常寄居于人上呼吸道，為條件致病菌，也是兒童社區獲得性感染的主要致病菌。感染Hi的兒童占全部感染人群的20%[1-2]，在革蘭陰性桿菌所致的肺炎中位居第三[3]，可引起肺炎、支氣管炎、化膿性腦膜炎、血流感染和中耳炎等感染性疾病，嚴重威脅兒童的身體健康[4-5]。氨芐西林作為治療Hi的主要抗菌藥物，近年來耐藥率不斷上升。產β-內酰胺酶是Hi對氨芐西林耐藥的主要機制，不產β-內酰胺酶氨芐西林耐藥（beta-lactamase-negetive ampicillin-resistance strains，BLNAR）菌目前占耐藥株的8%～10%[6-7]，逐漸受到臨床關注，但其耐藥機制及分子流行病學特征目前尚不明確。本研究對117株Hi臨床分離株進行耐藥性、氨芐西林耐藥機制及同源性分析，以期為臨床抗感染治療和控制耐藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

117株Hi菌株（剔除重復菌株）均分離自2018年4—6月上海交通大學附屬兒童醫院住院患兒各類臨床樣本，其中114株分離自痰液樣本，2株分離自鼻咽拭子樣本，1株分離自肺泡灌洗液樣本。所有菌株均接種于40%甘油肉湯菌種保存液，-80 ℃冰箱保存。

1.2 試劑與儀器

巧克力平板（上海科瑪嘉微生物有限公司），氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、克拉霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢類、氯霉素、左氧氟沙星及美羅培南等抗菌藥物粉劑、硝酸噻吩試紙（英國Oxiod公司），WHB 96孔藥物敏感性試驗微孔板（美國賽默飛世爾公司），引物合成、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒及1 000 bp相對分子質量標準[生工生物工程（上海）有限公司]，Z480 PCR擴增儀（瑞士羅氏公司），Gel DocXR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），測序由上海柏辰生物公司完成。

1.3 方法

1.3.1 Hi菌株復蘇及鑒定 將保存于-80 ℃的Hi菌株復蘇，分區劃線接種于巧克力平板，35℃、5%CO2條件下培養20～24 h，挑取巧克力平板上可疑菌落密集劃線于TSA平板上，并貼上V、X及V+X因子紙片，于37℃、5%CO2條件下培養20～24 h。若出現衛星現象（即V、X因子周圍不生長，僅在V+X因子周圍生長）則鑒定為Hi。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法進行體外藥物敏感性試驗，質控菌株Hi （ATCC 49247），結果判讀參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S26文件。

1.3.3 氨芐西林耐藥Hi菌株β-內酰胺酶檢測 用頭孢硝噻紙片刮取少許巧克力平板上耐氨芐西林Hi菌落，15 min內觀察，若紙片變紅為β-內酰胺酶陽性，反之為陰性。

1.3.4 氨芐西林耐藥Hi菌株DNA模板制備 采用煮沸法提取氨芐西林耐藥菌株DNA模板。挑取1接種環的Hi菌落，置于含有300 μL無菌0.9%氯化鈉溶液的無菌Eppendorf管中研磨均勻，100 ℃恒溫金屬浴中溫浴10 min，1 500×g離心機離心1 min，吸取上清液即為細菌DNA模板，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.5 氨芐西林耐藥HiTEM-1、ROB-1及ftsI基因PCR擴增 （1）引物設計。依據文獻[6-7]與GeneBank數據庫設計β-內酰胺酶TEM-1、ROB-1基因及編碼青霉素結合蛋白3的ftsI基因引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，并經過次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷酸純化。引物序列見表1。（2）PCR擴增體系。PCR反應體系總體積為50 μL：10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5 μL，Mg+3 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模版5 μL，無菌去離子水補足至50 μL。擴增條件：94 ℃預變性7 min；94 ℃ 30 s，56 ℃（以TEM-1為例，其余基因引物退火溫度見表1）30 s，72 ℃ 30 s循環30次；72 ℃延伸3 min。

1.3.6 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL擴增產物與1 μL 6×LoadingBuffer混勻，上樣于2%瓊脂糖凝膠加樣槽中，同時留1個空孔加入5 μL 1 000 bp相對分子質量標準，恒壓100 V 30 min，于凝膠成像系統下觀察擴增條帶。

表1 TEM-1、ROB-1及ftsI基因引物序列

1.3.7ftsI基因測序 將PCR擴增后的ftsI基因進行測序，測序結果與Hi的RdKW20標準菌株的ftsI基因進行Blast比對。

1.3.8 氨芐西林耐藥菌株多重PCR基因分型 （1）引物設計。依據參考文獻[8]與GeneBank數據庫設計多重PCR基因引物，其中一對引物來自Hi特異具有長度多態性的染色體DNA片段Hinf，另一對引物來自外膜蛋白P1-Hamp。引物序列見表2。（2）多重PCR擴增體系。10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5 μL，Mg+7 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模版5 μL，無菌去離子水補足至50 μL。擴增條件：94 ℃預變性7 min；94 ℃45 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s循環30次；72 ℃延伸7 min。擴增產物經2.5%凝膠電泳40 min，擴增條帶通過GIS ID分析軟件進行分型。

1.4 統計學方法

采用SAS V8軟件進行統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hi耐藥性分析

H i對復方磺胺甲噁唑的耐藥率最高（80.3%），對頭孢類、氯霉素、左氧氟沙星及美羅培南的敏感率均高于80%。見表3。

表2 Hinf及Hamp基因引物序列

表3 Hi對抗菌藥物的耐藥性

2.2 氨芐西林耐藥Hi菌株β-內酰胺酶檢測及產酶基因檢測

66株氨芐西林耐藥Hi中有54株產β-內酰胺酶，12株不產β-內酰胺酶，β-內酰胺酶檢出率為46.2%（54/117）。54株產β-內酰胺酶氨芐西林耐藥（beta-lactamase-positive ampicillin-resistance strains，BLPAR）菌產酶基因均為TEM-1基因，未檢出ROB-1基因，凝膠電泳圖見圖1。

2.3 BLNAR菌與BLPAR菌耐藥性分析

BLPAR菌株對9種抗菌藥物的耐藥率均高于BLNAR菌株，但2類耐藥菌株只對大環內酯類與磺胺類抗菌藥物的耐藥率差異有統計學意義（P＜0.05），對頭孢類和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

圖1 TEM-1基因檢測結果

表4 BLPAR與BLNAR Hi菌株對抗菌藥物的耐藥率與敏感率

2.4 氨芐西林耐藥Hi菌株ftsI基因擴增及測序

66株氨芐西林耐藥Hi均擴增出ftsI基因，凝膠電泳圖見圖2。測序結果顯示BLPAR菌中有37株HiftsI基因發生氨基酸置換，突變率為68.5%（37/54），BLNAR菌中有9株ftsI基因發生氨基酸置換，突變率為75.0%（9/12）；依據不同氨基酸置換形式可將ftsI基因分為不同的基因型[9]，2種菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主，且SSN序列盒附近均以Ser385Thr置換形式為主，BLPAR菌與BLNAR菌發生Asn526Lys置換合并Ser385Thr置換分別占51.4%（19/37）、77.8%（7/9）；BLPAR菌中有2株發生氨基酸置換，但不可分型，1株菌同時具有Ⅰ與Ⅱ型的氨基酸置換形式。37株ftsI基因突變BLPAR菌與9株ftsI基因突變BLNAR菌氨基酸置換形式見表5。

圖2 ftsI基因檢測結果

表5 BLPAR與BLANR菌不同氨基酸置換形式菌株數

2.5 氨芐西林耐藥Hi多重PCR分型結果

66株氨芐西林耐藥Hi通過多重PCR分型共分為a、b、c、d、e 5個型[8]。BLPAR菌5個型均有，BLNAR菌僅有a型和e型，不同分型均具有克隆傳播趨勢。2種菌均以a型為主，分別占63%（34/54）和75%（9/12）。凝膠電泳圖見圖3。

圖3 多重PCR分型結果

3 討論

Hi是一種條件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，以1～10歲的兒童感染為主[10]，于2—5月及冬春季分離率最高[11]。本研究菌株分離自2018年4—6月（第二季度），患兒年齡均在10歲以內，以患有支氣管肺炎為主，分離樣本以痰液為主，補充了秦惠宏等[6]對2016年第一季度141株Hi臨床分離株的相關研究。

氨芐西林作為β-內酰胺酶類抗菌藥物被用于治療由Hi引起的各種感染，但隨著其被廣泛使用，耐藥率也呈上升趨勢。我國2007—2014年CHINET細菌耐藥性監測數據顯示，Hi對氨芐西林的耐藥率由30.1%[12]上升至41.8%[7]。Hi對氨芐西林耐藥的機制為產β-內酰胺酶，已知的β-內酰胺酶基因型主要有TEM和ROB型[10]，其中以TEM-1型為主[13]。同時還存在其他耐藥機制。2007—2014年，我國BLNAR菌株由2.7%[12]上升至8.6%[7]。國外BLNAR菌株占Hi的22.8%～40.8%[14-15]，明顯高于我國，以日本尤為嚴重，可能是因地區不同而導致耐藥機制出現差異。本研究117株Hi中氨芐西林耐藥率為56.4%，β-內酰胺酶檢出率為46.2%，產β-內酰胺酶耐藥基因均為TEM-1基因，提示產TEM-1型β-內酰胺酶仍是氨芐西林耐藥Hi的主要耐藥機制，β-內酰胺酶陰性耐藥菌株檢出率為10.3%，與秦惠宏等[6]報道的相關數據（53.2%、44.7%、12.8%）基本一致，提示上海地區耐氨芐西林Hi檢出率及不同機制構成比相對穩定。Hi對復方磺胺甲噁唑的耐藥率最高，對氨芐西林-舒巴坦、克拉霉素有較高的耐藥率，對頭孢類、氯霉素、氟喹諾酮及碳青霉烯類藥物有較高的敏感率，可能與兒童用藥選擇性有關，對氨芐西林與磺胺類抗菌藥物的高耐藥率表明Hi菌株已經不適合采用這2種抗菌藥物進行經驗治療。BLPAR菌株對抗菌藥物的耐藥率均高于BLNAR菌株，但2種菌只對大環內酯類與磺胺類抗菌藥物的耐藥率有統計學意義（P＜0.05），對頭孢類、碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均無統計學意義（P＞0.05），可見BLPAR所致耐藥比BLNAR所致耐藥對抗菌藥物耐藥性的影響更為顯著。

既往研究發現，Hi的BLANR菌株耐藥機制可能與ftsI基因突變導致青霉素結合蛋白3與β-內酰胺類抗菌藥物的親和力下降有關。根據不同位點的氨基酸置換，UBUKATA等[9]根據ftsI基因測序結果將Hi分為Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型。有文獻報道BLNAR菌以Ⅱ型為主，并首次檢出了同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLNAR菌株[16]。秦惠宏等[6]發現我國上海地區HiftsI基因分型以Ⅲ型為主。表明不同時間、不同國家、不同地區可能會因用藥習慣不同而導致ftsI基因型不同。本研究結果顯示，54株BLPAR中有37株ftsI基因發生氨基酸置換，突變率為68.5%，表明BLPAR菌除產酶機制以外，也可能同時存在ftsI基因突變機制。這2種機制同時存在的BLPAR菌被稱為β-內酰胺酶陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥Hi。BLNAR菌中有9株ftsI基因發生氨基酸置換，突變率為75.0%（9/12），BLNAR菌中有3株菌未發生ftsI基因突變，提示可能存在著其他耐藥機制，如外排泵機制等。2種菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主，與秦惠宏等[6]的研究結果一致，表明上海地區氨芐西林耐藥HiftsI基因型別相對穩定。不同的ftsI基因型可能是由不同地區用藥習慣不同所致。本研究中ftsI基因氨基酸置換形式均以KTG基序附近發生Asn526Lys置換合并SSN基序附近發生Ser385Thr置換為主；BLPAR菌中有2株菌發生氨基酸置換，但不可分型，1株菌同時具有Ⅰ與Ⅱ型的氨基酸置換形式。此外，本研究檢出了同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLPAR菌株，值得關注。

多重PCR因基因分型能力與脈沖場凝膠電泳分型能力接近，且比脈沖場凝膠電泳分型方法簡便、快捷[17]，通常被用于對細菌進行基因分型，從而判定菌株親緣關系，了解細菌的同源性及分子流行病學特點。本研究多重PCR結果表明，BLPAR菌分為a、b、c、d、e型，BLNAR菌分為a、e型，且均有克隆傳播趨勢；2種菌均以a型為主，表明氨芐西林耐藥Hi以a型為主，與姜敏等[17]的報道一致。不同分型與抗菌藥物耐藥性及不同氨芐西林耐藥機制并無明顯的相關性，但都存在克隆傳播趨勢。

綜上所述，Hi對氨芐西林與磺胺類抗菌藥物的高耐藥率使這2種抗菌藥物不適合用于Hi的常規用藥；氨芐西林耐藥Hi的耐藥機制以產TEM-1型β-內酰胺酶為主，不產酶的耐藥機制主要是由KTG基序附近發生Asn526Lys置換合并SSN基序附近發生Ser385Thr置換介導ftsI基因突變所致，部分產酶菌株可以同時存在ftsI基因突變，突變機制同不產酶耐藥株。2種耐藥菌ftsI基因型均以Ⅲ型為主；產酶耐藥株比不產酶耐藥株對抗菌藥物耐藥性的影響更為顯著；BLPAR菌與BLNAR菌均存在克隆傳播趨勢。本研究中分離出同時含有Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe 3種氨基酸置換的BLPAR菌株，另有3株BLNAR未發生ftsI基因突變，可能存在著其他耐藥機制，有待于進一步研究。密切觀察Hi耐藥性、氨芐西林耐藥機制及同源性，有助于臨床合理進行抗感染治療和控制耐藥。