替加環(huán)素聯(lián)合亞胺培南對黏液型銅綠假單胞菌的體外抗菌活性及生物膜抑制作用分析

鐘 峰， 馮 藝， 張晶晶， 許 巖， 方詠梅， 陶秀彬， 吳 競

（1.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241000；2. 安徽省婦幼保健院病理科，安徽 合肥230001；3. 皖南醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的主要病原菌之一，常引起肺部、尿路等多部位嚴(yán)重感染[1]。在進(jìn)行侵入性治療時，插管、引流管等可引起外源性感染，也是導(dǎo)致細(xì)菌生物膜產(chǎn)生及誘發(fā)因素之一。有研究結(jié)果表明，銅綠假單胞菌生物膜與臨床感染毒力、耐藥性有主要關(guān)系，碳青霉烯類耐藥菌株的生物膜形成能力較敏感菌株明顯升高[2-3]。因此，亟需一種有效的用藥方案，以解決形成生物膜菌株的耐藥問題。

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與浮游細(xì)胞相對應(yīng)的生長方式，通過自身合成的多糖蛋白復(fù)合物黏附在固體表面，并在糖蛋白復(fù)合物中生長繁殖而形成的細(xì)菌群落[4]。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物可通過抑制銅綠假單胞菌生物群體密度感應(yīng)系統(tǒng)而抑制細(xì)菌生物膜的形成[5]，但由于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物抗菌譜較窄，且耐藥率逐年升高，在臨床治療時往往效果并不理想。亞胺培南對革蘭陰性菌的抗菌活性較強(qiáng)，抗菌譜較廣[6]，但單獨(dú)使用穩(wěn)定性差，且肝臟毒副作用大，對細(xì)菌生物膜的抑制及破壞作用較差。本研究擬探討替加環(huán)素聯(lián)用亞胺培南對黏液型銅綠假單胞菌（mucoidPseudomonas aeruginosa，MPA）的抗菌活性及生物膜抑制作用，為臨床抗感染治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2016年9月—2018年5月皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院分離自臨床樣本（痰、中段尿和分泌物等）的89株MPA，剔除分離自同一患者相同部位的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 主要儀器和試劑

VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀、DR100型比濁儀（法國生物梅里埃公司），96孔細(xì)菌培養(yǎng)板、全功能微孔板檢測酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物公司），替加環(huán)素、亞胺培南（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），M-H培養(yǎng)基、MHB培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）。

1.3 方法

1.3.1 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測定替加環(huán)素和亞胺培南對89株MPA的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將替加環(huán)素和亞胺培南倍比稀釋成0.062 5～32 μg/mL系列濃度的菌液，分別注入無菌的96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，每孔200 μL，每排設(shè)2個空白對照孔，用MHB營養(yǎng)肉湯將培養(yǎng)18～24 h的MPA配制成濃度為1.0×106CFU/mL的菌液，每孔加入200 μL，混勻，放入37℃溫箱培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果，此MIC為無菌生長的最低藥物濃度。

1.3.2 聯(lián)合用藥效果評價(jià) 采用棋盤滴定法測定替加環(huán)素和亞胺培南體外協(xié)同效應(yīng)，用MHB營養(yǎng)肉湯將替加環(huán)素和亞胺培南倍比稀釋成0.062 5～32 μg/mL系列濃度的菌液，以棋盤法將不同濃度的藥物兩兩組合，加入到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，再加入濃度為1.0×106CFU/mL的菌液，設(shè)置陰性對照（MHB培養(yǎng)基）和陽性對照（不加藥物），放入37℃溫箱培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果，兩藥聯(lián)合的MIC為微孔內(nèi)液體澄清的最低藥物濃度。采用分級抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）判定2種藥物聯(lián)用對MPA的抑菌作用。FICI=聯(lián)用時A藥的MIC/單A藥的MIC+聯(lián)用時B藥的MIC/單B藥的MIC。判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2為拮抗作用[7]。

1.3.3 時間殺菌曲線實(shí)驗(yàn) 設(shè)置0.5 MIC亞胺培南組、0.5 MIC替加環(huán)素組、0.5 MIC亞胺培南+替加環(huán)素組、對照組（MIC為0）4個組。菌液濃度均為1.0×106CFU/mL，抗菌藥物終濃度為該藥物的亞MIC。混勻后放入37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，分別于0、2、6、12、24 h吸取100 μL培養(yǎng)液，用無菌0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋4次后涂板，常規(guī)培養(yǎng)18～24 h后計(jì)數(shù)，取計(jì)數(shù)值的對數(shù)繪制出時間殺菌曲線，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)判斷2種藥物聯(lián)用后的殺菌效應(yīng)。殺菌/抑菌效應(yīng)定義：培養(yǎng)24 h細(xì)菌濃度比初始接種細(xì)菌濃度降低＞3 log10CFU/mL；協(xié)同效應(yīng)定義：培養(yǎng)24 h聯(lián)合組細(xì)菌濃度比最強(qiáng)單藥組細(xì)菌濃度降低≥2 log10CFU/mL[8]。

1.3.4 生物膜抑制實(shí)驗(yàn) 將替加環(huán)素和亞胺培南聯(lián)合用藥為協(xié)同作用效應(yīng)的6株MPA[3]和質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）分別接種于MHB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，用比濁儀將菌液濃度分別調(diào)整為1.0×106CFU/mL，注入無菌96孔細(xì)菌培養(yǎng)板（質(zhì)控菌株為陽性對照，空白對照孔內(nèi)只加MHB），用MHB培養(yǎng)基分別將替加環(huán)素稀釋成1、1/2、1/4 MIC系列濃度，將亞胺培南稀釋成1、1/2、1/4 MIC系列濃度。以棋盤法將不同濃度的替加環(huán)素和亞胺培南進(jìn)行兩兩組合，37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，加入100%甲醇200 μL固定20 min，棄去固定液后加入0.5%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗后晾干，加入33%冰乙酸200 μL。用酶標(biāo)儀檢測96孔板內(nèi)液體在波長570 nm處的吸光度（A570nm）值，每株菌株設(shè)立3個復(fù)孔，計(jì)算經(jīng)抗菌藥物作用組與未經(jīng)抗菌藥物作用組的A570nm均值，均值越低，表示抗菌藥物對生物膜的抑制能力越強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物單用及聯(lián)用對MPA的MIC比較

采用微量肉湯稀釋法檢測替加環(huán)素、亞胺培南單用及聯(lián)用對89株MPA的MIC，得出的MIC分別為0.0625～2 μg/mL和0.125～2 μg/mL，89株MPA均為敏感菌株。MIC50分別為0.25 μg/mL和1 μg/mL，MIC90分別為0.5 μg/mL和2 μg/mL（表1）。FICI指數(shù)結(jié)果分析得出2藥聯(lián)合應(yīng)用對MPA的協(xié)同作用為46.07%（41株）、部分協(xié)同作用為14.6%（13株）、相加作用為12.36%（11株）、無關(guān)作用為26.97%（24株）、無拮抗作用。2種藥物聯(lián)用對89株MPA的累計(jì)抑菌百分率（cummulative inhibitory ratio，CIR）見圖1。相比單獨(dú)用藥，替加環(huán)素與1/2 MIC亞胺培南聯(lián)用的累計(jì)抑菌曲線明顯左移，在相同CIR下，替加環(huán)素與亞胺培南聯(lián)用較單用所需的藥物濃度低。在相同的給藥濃度下，聯(lián)合用藥的抗菌作用明顯增強(qiáng)。

表1 替加環(huán)素與亞胺培南單用及聯(lián)用對MPA的MIC μg/mL

圖1 替加環(huán)素與亞胺培南單用及聯(lián)用對MPA的MIC CIR曲線

2.2 替加環(huán)素與亞胺培南聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取亞胺培南和替加環(huán)素聯(lián)合用藥有協(xié)同作用的6株MPA，在聯(lián)合應(yīng)用亞胺培南和替加環(huán)素24 h后菌落數(shù)均減少，較最強(qiáng)單藥組濃度降低≥2 log10CFU/mL，聯(lián)合用藥對6株MPA均表現(xiàn)為協(xié)同作用。見圖2。

2.3 亞胺培南和替加環(huán)素對MPA生物膜的體外作用效應(yīng)

在無亞胺培南作用時，1/4、1/2 MIC替加環(huán)素與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；加入1/4、1/2或1 MIC替加環(huán)素后與單獨(dú)使用1/4 MIC替加環(huán)素相比，A570nm值明顯下降（t值分別為2.45、2.24、2.07，P＜0.05）。在無替加環(huán)素作用時，1/4、1/2 MIC亞胺培南與0 MIC比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；加入1/4、1/2或1 MIC替加環(huán)素后與單獨(dú)應(yīng)用1/4 MIC亞胺培南相比，A570nm值明顯下降（t值分別為2.47、2.35、2.16，P＜0.05）。見表2。

圖2 替加環(huán)素（1/2 MIC）與亞胺培南（1/2 MIC）單用及聯(lián)用的時間殺菌曲線

表2 替加環(huán)素聯(lián)合亞胺培南對MPA生物膜的作用效應(yīng)（A570nm值） ±s

表2 替加環(huán)素聯(lián)合亞胺培南對MPA生物膜的作用效應(yīng)（A570nm值） ±s

注：與同一濃度單用亞胺培南對照組（MIC=0）比較，* P＜0.05；與同一濃度單用替加環(huán)素對照組（MIC=0）比較，#P＜0.05

亞胺培南MIC替加環(huán)素MIC 0 0.261±0.006 0.214±0.005* 0.211±0.009* 0.136±0.004*1/4 0.248±0.005 0.189±0.008*# 0.175±0.006*# 0.129±0.01*1/2 0.227±0.004 0.164±0.005*# 0.136±0.001*# 0.125±0.005*1 0.128±0.007# 0.13±0.003# 0.126±0.006# 0.126±0.004 1/4 1/2 1 0

3 討論

銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制主要包括形成生物膜、主動外排系統(tǒng)和藥物滲透障礙等，特別是MPA黏液化與生物膜形成有關(guān)，一般認(rèn)為MPA為形成生物膜的陽性菌株，MPA和非黏液型銅綠假單胞菌均能形成生物膜，但兩者形成生物膜的表型及階段特異性存在差異[9-10]。有研究結(jié)果表明，MPA比非黏液型銅綠假單胞菌感染持續(xù)時間更長，更不易清除，能夠使菌體逃脫宿主免疫系統(tǒng)的清除[11]，同時由于胞外黏多糖的屏障作用，使得抗菌藥物難以滲透入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致MPA相關(guān)的慢性感染易反復(fù)，且難以清除，給臨床治療帶來嚴(yán)重困擾[12-13]。

近年來，由于多重耐藥銅綠假單胞菌不斷增多，且氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物的不良反應(yīng)，碳青霉烯類抗菌藥物已成為治療首選，但是由于銅綠假單胞菌生物膜的形成，增加了其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性。有研究結(jié)果表明，替加環(huán)素的抗菌作用機(jī)制是以陽離子-四環(huán)素類復(fù)合物穿過細(xì)菌外膜，積聚于包膜間質(zhì)，再通過彌散方式透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并與核糖體30S亞基結(jié)合，阻斷氨酰基-轉(zhuǎn)移RNA進(jìn)入A位點(diǎn)，通過阻斷肽鏈的延長來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成及細(xì)菌的生長[14]。本研究聯(lián)用亞胺培南和替加環(huán)素，計(jì)算FICI指數(shù)，分析得出2種藥物聯(lián)用對MPA主要為協(xié)同及相加作用，無拮抗作用，替加環(huán)素能明顯降低亞胺培南的MIC50值（P＜0.05），在相同的給藥濃度下，聯(lián)合用藥的抗菌作用明顯增強(qiáng)。

有生物膜的MPA對抗菌藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，給臨床治療帶來極大困擾，單獨(dú)使用1種抗菌藥物難以清除生物膜。目前，在破壞細(xì)菌生物膜的方法中，碳青霉烯類抗菌藥物與小劑量大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物聯(lián)用效果較好[15]，但關(guān)于甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物對黏液型細(xì)菌體外抑菌作用的研究較少，替加環(huán)素甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物主要被用于治療復(fù)雜性腹腔及軟組織感染。有研究結(jié)果顯示，替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌形成的生物膜具有明顯抑制作用，通常作為一、二、三線抗菌藥物治療失敗或?qū)η嗝顾剡^敏及不能耐受其他藥物患者的治療選擇[16]。本研究結(jié)果顯示，替加環(huán)素能夠抑制MPA的生物膜，并且在MIC范圍內(nèi)，隨著抗菌藥物濃度的增加，生物膜抑制的程度逐漸增加。但單獨(dú)應(yīng)用不同濃度的亞胺培南（1/4、1/2 MIC）對生物膜的抑制作用無差異，可能是生物膜阻礙了亞胺培南進(jìn)入生物膜內(nèi)，導(dǎo)致殺菌作用被抑制。但在亞胺培南濃度相同的情況下，加入1/4或1/2 MIC的替加環(huán)素可以使細(xì)菌生物膜明顯減少；在替加環(huán)素濃度相同的情況下，加入1/4或1/2 MIC的亞胺培南也可以使細(xì)菌生物膜明顯減少，提示2種藥物聯(lián)用可明顯抑制MPA生物膜的形成。

抗菌藥物的不合理使用使多重耐藥菌日漸增多，單獨(dú)使用抗菌藥物難以完全清除處于生物膜保護(hù)下的細(xì)菌。抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用不僅能協(xié)同抑菌，還可降低藥物的毒副作用及誘導(dǎo)突變耐藥作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用替加環(huán)素，不僅具有協(xié)同抑制MPA的效果，而且還能抑制生物膜的形成，臨床應(yīng)用價(jià)值顯著。但這種協(xié)同作用局限于體外試驗(yàn)，在體內(nèi)是否有協(xié)同作用，仍需要更多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。