miRNA-21-5p對食管癌的診斷價值及其與STAT3的相關性研究

王燕忠， 丁麗敏， 陳一瑞， 王永斌

（1.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院下沙院區檢驗科，浙江 杭州 310016；2.浙江省人民醫院血液內科，浙江 杭州 310014；3.揚州大學附屬醫院，江蘇 揚州 225001）

食管癌是一種嚴重影響人們生活水平的消化系統惡性腫瘤[1]。近年來食管癌在我國的發病率和致死率居高不下，我國已成為食管癌高發的國家之一。食管癌的臨床癥狀不明顯，被發現時多為晚期，因此尋找食管癌發生的生物學標志物，對于食管癌的及早發現和有效治療具有重要的意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種調節內源性基因的非編碼小RNA，由基因組轉錄生成并通過與靶基因的3'端互補配對，降解靶基因或抑制其翻譯而發揮治療作用[2]。據推測，人類1/3的基因受到miRNA調控，因此在人類生長發育和疾病的發生、發展中起著重要調節作用[3]。可調控信號傳導和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）作為影響食管癌細胞增殖和凋亡的重要指標，其表達量嚴重影響著食管癌的發展，因此本研究探討miRNA-21-5p與STAT3之間的靶向關系，為食管癌的治療提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年6月在浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院下沙院區治療的食管癌患者78例（病例組），其中男37例、女41例，中位年齡為（46±3.9）歲。對照組是69名體檢健康者，其中男33名、女36名，中位年齡為（47±4.0）歲。病例組和對照組的一般信息之間差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：（1）所有食管癌患者均首次經檢查確診，符合食管癌診斷標準，具備完整的食管癌病歷資料；（2）患者入組前未進行治療或者藥物干預；（3）術后經病理診斷證實為食管癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，無轉移。排除標準：（1）病歷或基本資料不完整；（2）患有多種腫瘤；（3）患者間身體狀況存在較大差異。本研究符合浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院下沙院區倫理學相關要求，且所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 血液采集及miRNA-21-5p表達檢測

采集食管癌患者、體檢健康者禁食10～12 h后清晨空腹靜脈血5 mL，室溫放置，待充分凝固后離心，吸取血清置-80℃保存。根據血清miRNA提取分離試劑盒（日本Thermo Fisher公司）說明書要求提取血清中miRNA并測定其濃度，用Bulge-Loop TM hsa-miR RT（北京天根生化科技有限公司）代替Oligo（dT）進行逆轉錄，逆轉錄莖環狀結構的引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'。將逆轉錄后的產物應用擴增miRNA qRT-PCR試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測，反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40個循環。miRNA-21-5p的引物由廣州銳博科技有限公司合成，上游引物為5'-CGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'。下游引物為5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；同時利用U6作為內參，U6的上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，采用2-ΔΔCt法計算miRNA-21-5p/U6的相對表達量。以上所有實驗均重復3次。

1.3 預測miRNA-21-5p調控的下游靶基因

利用picTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、Tarbase（http：//diana.imis.athenainnovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）3個miRNA數據庫分別預測miRNA-21-5p調控的下游靶基因。

1.4 Draw venn diagram篩選靶基因交集

將picTar、TargetScan、Tarbase 3個數據庫預測的miRNA-21-5p的下游靶基因分別導入Draw venn diagram，取出3個數據庫預測的靶點交集，并且篩選出與食管癌相關靶點。

1.5 實時PCR檢測食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3 mRNA的表達

取食管癌根治性切除術患者癌組織和癌旁組織各1份，用液氮冷凍后在-80 ℃儲存待測。根據試劑盒說明提取癌組織和癌旁組織中總RNA并測定其濃度，反轉錄后進行實時熒光定量PCR擴增，熔解曲線和擴增曲線見圖1、圖2。STAT3上游引物為5'-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3'，下游引物為5'-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3'，同時用3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，GAPDH上游引物為5'-GCTGAGTATGTCGTGGAGT-3'，下游引物為5'-GTTCACACCCATCACAAAC-3'。PCR擴增體系：SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，互補DNA（complementary DNA，cDNA）4 μL，H2O 5 μL，共20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算STAT3/GAPDH的相對表達量。以上所有實驗均重復 3 次。

圖1 熔解曲線

圖2 擴增曲線

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量數據以±s表示，多組之間的比較采用方差分析，2個組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-21-5p在食管癌患者血清中的表達

實時熒光定量PCR結果顯示，miRNA-21-5p在食管癌患者血清中表達量（1.01±0.19）顯著高于體檢健康者血清中的表達量（0.23±0.07）（P=0.00）。進一步分析不同分期的食管癌患者血清中的miRNA-21-5p表達情況，發現Ⅲ期患者的表達量（1.13±0.11）顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者（0.92±0.09）（P=0.01），說明miRNA-21-5p的表達量與食管癌分期有關，miRNA-21-5p表達量越高，分期越晚。這些結果說明，miRNA-21-5p高表達可以作為食管癌患者的特異性標志。

2.2 miRNA-21-5p可靶向調控STAT3

通過3個miRNA數據庫分別預測miRNA-21-5p調控的下游靶基因，PicTar預測出靶基因148個、TargetScan預測出384個、Tarbase預測出742個，3個數據庫取交集得到miRNA調控的靶基因有24個，其中STAT3為miRNA-21-5p調控并且與食管癌細胞的增殖和凋亡密切相關。

2.3 食管癌患者癌組織STAT3 mRNA高表達

采用實時熒光定量PCR檢測食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3 mRNA的表達，發現在食管癌患者癌組織中STAT3 mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織（P=0.01），并且根據Spearman相關性分析發現，其與血清中miRNA-21-5p的表達呈正相關（r=0.401，P=0.00）。見圖3。

圖3 STAT3、miRNA-21-5p實時熒光定量PCR檢測結果

3 討論

食管癌的發生由多因素影響且特性復雜，因此了解食管癌發生的分子機制并且找到食管癌有效的治療途徑迫在眉睫。miRNA是一種長度為21～24 nt的非編碼小RNA，通過與靶基因3'非翻譯區相結合而調控靶基因表達，亦可通過降解靶基因或抑制其翻譯而發揮治療作用[4]，miRNA與多種疾病相關，并且調控著疾病的不同發展階段。有研究結果表明，在食管癌組織和正常食管組織中，miRNA的表達存在顯著差異，異常表達的miRNA可以作為癌癥的生物學標志，預測癌癥的發生[5]。齊天偉等[6]發現，miRNA-200c顯著降低可以作為食管癌發病的生物學標志，miRNA-34a可通過影響抑制食管癌細胞的增殖及凋亡達到治療疾病的作用[7]，多種miRNA可以通過調控不同的信號分子治療同一種疾病。SONG等[8]發現，miRNA-16過表達可抑制細胞炎癥反應，并且miRNA-16可通過靶向B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因抑制細胞凋亡[9-10]，研究表明miR-16可以通過靶向調控淀粉樣B（A4）前體蛋白[myloid beta（A4） presursor protein，APP]等多種基因治療阿爾茨海默癥等多種疾病[11-13]，這也說明同種miRNA可以作用于不同靶點治療不同疾病。

本研究以食管癌患者血清為臨床樣本，并且與體檢健康者血液進行比較，發現在食管癌患者血清中miRNA-21-5p的表達顯著升高，而對照組血清樣本中miRNA-21-5p相對表達量較低。因此，本研究以miRNA-21-5p為研究重點，探討其在食管癌中的具體作用機制。通過生物信息學預測發現，miRNA-21-5p可調控多種靶基因，其中通過picTar、TargetScan、Tarbase分別預測其靶基因，發現其調控的靶基因數目分別為148、384、742個，并且我們通過Draw venn diagram取出3個數據庫篩選出的共有靶基因24個，其中STAT3是與食管癌細胞增殖和凋亡密切相關的基因，STAT3的持續激活會導致食管癌細胞的快速增殖，因此本研究通過實時熒光定量PCR檢測食管癌患者癌組織和癌旁組織中STAT3的表達差異，發現在食管癌患者癌組織中STAT3表達量顯著高與癌旁組織，并且其表達水平與血清中miRNA-21-5p表達水平呈正相關。本研究結果顯示，血清中miRNA-21-5p的異常升高可以作為食管癌發生的生物學標志，其作用機制可能與上調患者癌組織中STAT3表達促進食管癌細胞增殖有關。