CD55、CD59聯合嗜水氣單胞菌毒素變異體檢測對PNH的診斷價值

魯家才， 黃 瑩， 莫 揚， 周小芬， 姚 欣

（襄陽市中心醫院 湖北文理學院附屬醫院，湖北 襄陽 441021）

CD55、CD59屬于糖化肌醇磷脂（glycosylphatidylinositol，GPI）錨鏈膜蛋白，普遍存在于血細胞膜上。PIG-A基因突變可導致GPI錨鏈膜蛋白合成障礙，引起補體活化和細胞溶解。CD55、CD59缺陷是陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的主要臨床特征，部分干細胞疾病和淋巴增殖性疾病均可檢出PNH克隆[1-2]。嗜水氣單胞菌毒素變異體（fluorescent aerolysin，FLAER）能與細胞膜上的GPI錨鏈膜蛋白結合，聚合成多聚體，插入細胞膜脂質中，形成孔洞，使細胞滲透壓改變，從而被溶解。然而，血型糖蛋白與嗜水氣單胞菌毒素結合力較弱，限制了FLAER對紅細胞的檢測能力[3]。本研究旨在探討CD55、CD59聯合FLAER檢測對PNH的診斷價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年3月—2017年7月襄陽市中心醫院血液科貧血住院患者157例，其中男87例、女70例，年齡（48.1±19.3）歲。根據貧血診斷標準[4]，將其分為缺鐵性貧血（iron deficiency a n e m i a，I D A）3 8例、巨幼細胞性貧血（megaloblastic anemia，MA）23例、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）27例、再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）25例、自身免疫溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）31例、PNH 13例。另選取襄陽市中心醫院體檢健康者20名，作為正常對照組，其中男10名、女10名，年齡（48.9±14.5）歲，均無貧血史。

1.2 儀器與試劑

FC500流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；CD59-FITC、CD55-PE、CD45-PerCP、紅細胞裂解液購自美國BD公司；CD15-PE、CD14-APC、FLAER-FITC和磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

采集所有研究對象2.0 mL外周血，并進行乙二胺四乙酸二鉀抗凝處理。

1.3.1 紅細胞標記及檢測 取5 μL抗凝全血，加入含100 μL PBS的流式專用試管中，輕輕混勻，分別加入20 μL CD59和20 μL CD55，混勻，避光孵育15 min后，加入1 mL PBS，待檢。在FSCSCC散點圖上選定紅細胞群，設門、圈出欲分析的細胞群，計算紅細胞CD55和CD59表達水平。

1.3.2 粒細胞標記及檢測 取100 μL抗凝全血，加入流式專用試管中，加溶血素1 mL，充分混勻，避光孵育10 min后，300×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL PBS，300×g離心5 min，棄上清液，分別加入20 μL CD59和20 μL CD55，混勻，避光10 min后，加入0.3 mL PBS，待檢。在FSCSCC散點圖上選定粒細胞群，設門、圈出欲分析的細胞群，計算粒細胞CD55和CD59表達水平。

1.3.3 粒細胞、單核細胞FLAER檢測 取100 μL抗凝全血，加入CD45、CD14、CD15、FLAER抗體各10 μL，避光孵育30 min后，加溶血素2 mL，室溫下避光10 min，溶血完全后300 ×g離心5 min，棄上清液，用2 mL PBS洗滌2遍，重新懸于500 μL的PBS中，上機檢測。分析8 000個有核細胞，以SCC/CD45設門，分別圈出粒細胞和單核細胞。以FLAER-/CD15細胞百分比為粒細胞PNH克隆數，以FLAER-/CD14細胞百分比為單核細胞PNH克隆數。

1.4 統計學方法

由于外周血CD55-、CD59-離散程度較大，故數據資料采用CD55-、CD59-百分比表示。將CD55-、CD59-百分比＞10%視為對PNH有診斷價值；另將FLAER-百分比＞0.5%視為存在PNH克隆，對PNH有診斷價值[5]。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞和粒細胞CD55、CD59檢測結果

正常對照組紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-百分比均＜5%，PNH組紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，PNH組與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。PNH組CD55、CD59、FLAER陰性患者（陰性細胞過高患者）粒細胞CD55-、CD59-百分比分別高于紅細胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），見表2。

表1 各組CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

表1 各組CD55-、CD59-、FLAER-百分比 %，±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-比較，#P＜0.05

組別 例數 紅細胞CD55-紅細胞CD59-粒細胞CD55- 粒細胞CD59- 粒細胞FLAER- 單核細胞FLAERIDA組 38 3.61±1.63 2.22±1.97 2.24±1.47 2.71±2.80 0.02±0.03 0.03±0.02 MA組 23 3.32±1.31 2.46±1.89 2.35±1.77 2.51±0.90 0.03±0.02 0.03±0.02 MDS組 27 4.41±3.63 3.55±4.57 6.53±11.31 3.65±3.76 2.13±7.11 0.73±1.31 AA組 25 5.41±8.33 4.64±3.45 5.90±8.65 6.19±7.34 6.54±5.20 6.51±4.16 AIHA組 31 5.53±4.12 4.07±5.41 1.65±1.31 2.17±1.35 0.05±0.04 0.03±0.02 PNH組 13 27.52±15.50* 28.65±14.55* 45.10±15.20* 47.30±14.20* 75.10±20.30# 71.32±15.20#正常對照組 20 3.63±2.24 1.43±1.94 2.07±1.47 2.78±2.27 0.02±0.02 0.17±0.12

表2 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

表2 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者CD55-、CD59-百分比 %，±s

注：與紅細胞CD55-比較，*P＜0.05；與紅細胞CD59-比較，#P＜0.05

組別 例數 紅細胞CD55- 紅細胞CD59- 粒細胞CD55- 粒細胞CD59-MDS組 2 6.73±4.34 2.41±4.89 6.82±7.34 4.60±4.28 AA組 4 9.77±5.57 5.75±3.44 10.86±7.65 12.73±5.57 AIHA組 2 12.36±6.72 9.12±8.15 1.67±1.28 2.16±1.57 PNH組 13 27.52±15.50 28.65±14.55 45.1±15.20* 47.30±14.20#

2例MDS患者和4例AA患者CD55-、CD59-表達為陽性，但紅細胞、粒細胞表達沒有一致性。2例AIHA患者紅細胞CD55-、CD59-表達增多，但粒細胞表達正常。IDA和MA患者紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-表達均正常。

2.2 粒細胞和單核細胞FLAER檢測結果

PNH組粒細胞和單核細胞FLAER-百分比均＞50%，顯著高于紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05）。7例AA患者FLAER-百分比顯著高于4例MDS患者（P＜0.05），見表3。IDA和MA患者粒細胞和單核細胞FLAER-表達均正常。

表3 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者FLAER-百分比 %，±s

表3 各組CD55、CD59、FLAER陰性患者FLAER-百分比 %，±s

注：與MDS組比較，*P＜0.05

組別 例數 粒細胞FLAER-單核細胞FLAERMDS組 4 2.67±0.87 2.54±0.85 AA組 7 6.70±4.16* 6.31±4.03*PNH組 13 75.10±20.30 71.32±15.20

2.3 CD55、CD59與FLAER檢測結果比較

CD55、CD59與FLAER診斷PNH的符合率為100%。有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表達缺失，而CD55、CD59表達正常；有2例AIHA患者紅細胞CD55、CD59表達部分缺失，粒細胞CD55、CD59表達正常，FLAER表達正常。

3 討論

PNH是一種造血干細胞克隆缺陷性疾病，因X染色體上PIG-A基因發生突變，從而導致細胞膜GPI錨鏈膜蛋白缺陷，CD55、CD59等補體調節蛋白合成減少，細胞對補體敏感性增強，最終引起血管內溶血[6]。PIG-A基因突變在許多疾病中可見，如AA、MDS、漿細胞病、淋巴增殖性疾病[1-2]。本研究結果顯示，PNH組紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-百分比均＞20%，CD55、CD59、FLAER陰性患者粒細胞CD55-、CD59-百分比顯著高于紅細胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），這可能是PNH患者溶血或輸血導致紅細胞膜PNH克隆數減少所致。PNH組粒細胞和單核細胞FLAER-百分比均＞50%，顯著高于紅細胞和粒細胞CD55-、CD59-百分比（P＜0.05），說明FLAER檢測對PNH克隆檢測更敏感。錨鏈膜蛋白缺失程度與PNH患者病情有關[7-8]。

31例AIHA患者中有2例紅細胞CD55-、CD59-表達增多，但粒細胞表達正常，這可能是AIHA患者紅細胞GPI錨鏈膜蛋白輕度受損或被覆蓋所致，其FLAER表達未見異常，提示AIHA患者GPI合成沒有缺陷。本研究有3例AA患者和2例MDS患者FLAER表達缺失，而CD55、CD59表達正常，提示FLAER檢測相對于CD55、CD59檢測來說更敏感，更利于較小PNH克隆的檢測。

本研究27例MDS患者中有4例伴PNH克隆，這可能是造血干細胞基因錯義突變引起GPI合成缺陷所致，這些隨機產生的小克隆干細胞并沒有獲得生長優勢，表達不明顯，多為一過性出現，故MDS伴PNH患者的總體生存情況一般不受影響[9]。本研究25例AA患者中有7例伴PNH克隆，PNH克隆的發生與AA關系密切，少數病例在某些條件下可互相轉化或伴生，即先表現AA后出現PNH克隆，繼而轉為AA-PNH綜合征，PNH克隆可增多、減少或缺失[9-10]。AA患者PNH克隆的出現可能有助于患者血液學指標的恢復，AA-PNH綜合征患者無論是血液學反應率還是無病生存率均優于PNH克隆陰性者[11]，故明確AA和PNH的關系可能會有助于早期識別和診斷AA，然而PAH與AA治療反應之間可能無相關性[12]。

部分PNH患者因全血減少不易與AA、MDS伴有PNH克隆患者進行鑒別診斷，故CD55、CD59聯合FLAER檢測在PNH診斷及鑒別診斷中有重要價值。FLAER檢測能夠監測PNH患者或AA、MDS存在小克隆患者的免疫抑制治療情況，對疾病轉歸和療效觀察有著重要的作用。