COPD患者痰液中性粒細胞氧化吞噬功能及相關受體變化的臨床意義

閆佩毅， 張 驥， 涂煥平， 張 立， 仇 越， 張鋒英， 胡奕雯， 金 姝

（1.上海市普陀區人民醫院檢驗科，上海 200060；2.上海市普陀區人民醫院病理科，上海 200060；3.上海市普陀區人民醫院呼吸內科，上海 200060；4.上海市普陀區人民醫院中心實驗室，上海 200060）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，是一種常見、多發、高致死率的慢性呼吸系統疾病。中性粒細胞的聚集活化是COPD發生的重要環節之一，中性粒細胞及其組分均參與了COPD的發生、發展過程[1-2]。為了進一步闡明COPD可能的發病機制，本研究采用流式細胞術檢測COPD患者外周血及痰液的中性粒細胞氧化吞噬功能，同時檢測中性粒細胞表面的趨化因子C-C基序受體-1（chemokine C-C receptor-1，CCR1）和Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 、TLR4的表達，以期了解COPD患者中性粒細胞氧化吞噬功能的改變，探討COPD發病的可能機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年12月上海市普陀區人民醫院確診并住院治療的COPD急性發作期患者30例（COPD組），其中男16例、女14例，年齡35～82歲，依據慢性阻塞性肺疾病全球倡議（the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）指南2017版[3]的診斷標準確診。選取同期上海市普陀區人民醫院確診并住院治療的肺炎患者30例（肺炎組）作為疾病對照，其中男12例、女18例，年齡32～88歲。選取同期上海市普陀區人民醫院體檢健康者30名（正常對照組），其中男14名、女16名，年齡27～79歲。體檢健康者外周血白細胞（white blood cell，WBC）計數為（5.9～9.9）×109/L，中性粒細胞百分比為55.0%～68.7%，肝功能指標、腎功能指標及心血管系統指標均無異常。COPD組、肺炎組及正常對照組之間性別、年齡等臨床資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器

Alexa Fluor 488 標記鼠抗人CD282（TLR2）抗體（貨號558318，克隆號11G7）、Alexa Fluor 488標記小鼠IgG1同型對照（貨號557702，克隆號MOPC-21）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記鼠抗人CD284（TLR4）（貨號564215，克隆號TF901）、PE標記小鼠IgG1同型對照（貨號554680）、Alexa Fluor 647標記鼠抗人CD191（CCR1）抗體（貨號557914，克隆號53504）、Alexa Fluor 647標記小鼠IgG2b同型對照（貨號557903，克隆號27-35）、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）標記鼠抗人CD45抗體（貨號347464，克隆號2D1）、PerCP標記小鼠IgG1同型對照（貨號550672，克隆號MOPC-31C）、Lysing Solution溶血劑和FASC Flow緩沖液均購自美國BD公司。無熒光的染料二氫若丹明123（dihydrorhodamine123，DHR123；工作溶液濃度為30 μg/mL）、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；工作溶液濃度為10 μg/mL）均購自美國Sigma公司。二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司），80-2型臺式離心機（上海和欣科教設備有限公司），LA-920-3垂直層流潔凈工作臺（上海上凈設備有限公司），QL-901型旋渦混合器（江蘇海門醫療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有對象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，24 h內完成外周血中性粒細胞氧化吞噬功能及相關受體（TLR2、TLR4和CCR1）的檢測。肺炎患者和COPD患者早晨用生理鹽水漱口后，留取晨起第一口深部痰。用鑷子取痰栓，在顯微鏡下觀察鱗狀上皮細胞＜10個/高倍鏡視野、WBC＞25個/高倍鏡視野為合格痰標本。取空試管，稱重后，選取100～500 mg不含唾液的痰標本，放入已稱重的試管中，向痰液中加入4倍體積的0.1%DTT溶液，用一次性吸管抽吸幾次后置于37 ℃水浴箱內15 min，48 μm尼龍網過濾，濾液以150×g離心5 min，棄上清，沉淀用磷酸緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）重懸后150×g離心，棄上清，沉淀再次用PBS重懸，在顯微鏡下調整細胞數至 1×106/mL，作為待測樣本。

1.3.2 中性粒細胞氧化吞噬功能的檢測 取2支流式專用管，分別標記為對照管和刺激管，對照管中加入50 μL PBS，刺激管中加入50 μL PMA，每管分別加入全血或重懸的痰液50 μL，混勻后37 ℃溫育15 min。加入DHR123 25 μL，混勻，37 ℃避光溫育5 min。每管加入1 mL溶血素（痰液樣本無需加入溶血素），室溫避光反應10 min，150×g離心5 min，棄上清，加300 μL PBS重懸，上機檢測。先用對照管進行設置，用前向散射光（forward scatter，FSC）和側向散射光（side scatter，SS）進行調整，確保中性粒細胞可以清晰地顯示出來。設中性粒細胞門為R1，以對照管為陰性管，在直方圖上調整對照管的熒光強度在101之內，記為M1，收集刺激管中的細胞，在對應的直方圖上100～101（M1）為陰性細胞，DHR123熒光信號101以上的區域為陽性（M2），見圖1。記錄M2區域的“%Gated”值，即為中性粒細胞氧化吞噬陽性率，每個樣本R1門收集10 000個細胞。

圖1 中性粒細胞氧化吞噬能力檢測示意圖

1.3.3 中性粒細胞表面受體表達的檢測 取2支流式專用管，標記為對照管和測試管，測試管依次加入CD282-Alexa Fluor 抗體10 μL、CD284-PE抗體5 μL、CD191-Alexa Fluor抗體5 μL、CD45-PerCP抗體5 μL、50 μL全血或痰液樣本，對照管依次加入等量相對應的同型對照抗體和50 μL全血或痰液樣本，混勻后室溫避光溫育25 min，每管加入500 μL溶血劑（痰液樣本無需加入溶血素），混勻后室溫避光靜置10 min，150×g離心5 min，棄上清，加入PBS 1 mL，混勻，150×g離心5 min，棄上清，再加入PBS 300 μL重懸，上機檢測。利用SS和CD45-PerCP，以中性粒細胞群設門（R1），檢測中性粒細胞表面表達CD282（TLR2）、CD284（TLR4）、CD191（CCR1）的平均熒光強度（mean flourscence indensity，MFI）。數據采用Cell Quest軟件進行分析，每個樣本每次檢測10 000個細胞。2 h內完成檢測，以保證結果的準確性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，組間比較采獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關分析評估各項目之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中性粒細胞門R1的確立

在通過CellQuest軟件獲取的散點圖上，根據CD45-PerCP和SS的參數設定中性粒細胞門R1。見圖2。

圖2 不同樣本的流式散點圖

2.2 COPD組、肺炎組和正常對照組外周血中性粒細胞氧化吞噬功能及相關受體的表達

與正常對照組比較，肺炎組和C O P D組中性粒細胞氧化吞噬功能均顯著下降（P＜0.05），肺炎組與COPD組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。COPD組、肺炎組及正常對照組之間僅CCR-1表達差異均有統計學意義（P＜0.05），而TLR2、 TLR4表達3組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖3、圖4。

2.3 COPD組和肺炎組痰液中性粒細胞氧化吞噬功能及相關受體表達陽性率

與肺炎組比較，COPD組痰液中性粒細胞氧化吞噬功能顯著下降（P＜0.05），CCR1表達顯著升高（P＜0.05），TLR2和TLR4表達2個組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖5、圖6。

2.4 相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，COPD組痰液中性粒細胞氧化吞噬陽性率與CCR1表達呈負相關（r=-0.548，P＜0.01），與TLR2、TLR4表達均無相關性（r值分別為-0.206、-0.219，P＞0.05）。

表1 COPD組、肺炎組及正常對照組外周血中性粒細胞氧化吞噬百分率及相關受體陽性率比較 %，±s

表1 COPD組、肺炎組及正常對照組外周血中性粒細胞氧化吞噬百分率及相關受體陽性率比較 %，±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與肺炎組比較，#P＜0.05

組別 例數 氧化吞噬百分率 TLR2 TLR4 CCR1正常對照組 30 98.27± 2.58 59.62±19.32 48.70±27.57 61.77±25.89肺炎組 30 93.05±9.24* 54.33±32.86 40.62±22.93 29.04±28.16*COPD組 30 96.22± 3.28* 45.58±34.31 42.45±28.62 40.97±34.58#

圖3 COPD組、肺炎組及正常對照組外周血中性粒細胞氧化吞噬功能的流式直方圖

圖4 COPD組、肺炎組及正常對照組外周血中性粒細胞表面CCR1、TLR2及TLR4表達的流式直方圖

表2 COPD組和肺炎組痰液中性粒細胞氧化吞噬百分率及相關受體的陽性率 %，±s

表2 COPD組和肺炎組痰液中性粒細胞氧化吞噬百分率及相關受體的陽性率 %，±s

注：與肺炎組比較，*P＜0.05

組別 例數 氧化吞噬百分率 TLR2 TLR4 CCR1肺炎組 30 51.57±36.50 10.26±9.24 20.86±18.39 15.08±15.03 COPD組 30 33.60±31.73* 12.64±12.13 20.30±19.15 44.99±34.11*

圖5 肺炎組和COPD組痰液中性粒細胞氧化吞噬功能的流式直方圖

圖6 肺炎組和COPD組痰液中性粒細胞表面受體的流式直方圖

3 討論

COPD確切的發病機制目前尚不清楚，一般認為COPD以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡也在COPD發病中起重要作用[1]。

有研究結果顯示，中性粒細胞的氧化聚集是COPD發生的重要環節之一，中性粒細胞及其組分均參與了COPD的發生、發展[4-6]。趨化因子受體是以趨化因子為配體的跨膜受體家族，中性粒細胞表面的趨化因子受體，如CCR1是其向病原體感染部位遷移或向炎癥部位游走的關鍵分子。WANG等[7]的研究結果顯示，炎癥細胞上CCR1的表達與COPD的嚴重程度有關。TLR是一類天然的免疫受體，在各種炎癥反應細胞吞噬作用的調節和細胞信號傳導及細胞凋亡中起重要作用。TLR作為病原識別受體對中性粒細胞的功能起著決定性的作用，在炎癥的發生、發展及轉歸中發揮重要的調控作用[8]。

中性粒細胞在COPD的發病過程中起重要作用，但中性粒細胞胞質內的細胞毒性物質在殺傷入侵的病原微生物的同時可能也會造成自身組織細胞的損傷。目前的研究多聚焦于COPD患者中性粒細胞數量的增多是否由凋亡減少而引起細胞壽命延長導致，但還未找到中性粒細胞壽命延長的明確證據，甚至有一些研究結論相互矛盾[9-11]。近年來，學者們逐漸將研究方向轉向中性粒細胞自身功能方面。PRIETO等[12]的研究結果顯示，COPD患者存在多形核白細胞吞噬活性的缺陷。動物實驗已證實，在假單胞菌感染的鼠模型中，香煙煙霧提取物會削弱中性粒細胞的吞噬作用[13-14]。SAPEY等[15]的研究結果顯示，COPD患者中性粒細胞自身功能可能有缺陷，其趨化行為和移行結構與其他人群有著本質上的差異。為此，本研究對中性粒細胞的氧化吞噬功能進行了探討。因COPD屬于氣道炎癥，而肺炎為非氣道炎癥，以肺炎作為疾病對照可更好地證明研究結論是氣道炎癥所特有的。同時檢測COPD患者外周血與痰液中性粒細胞的氧化吞噬功能能更好地反映整體與局部的關系。

本研究采用的流式細胞術-DHR123方法是一種臨床常用的評價中性粒細胞氧化吞噬功能的方法。DHR123被激活的中性粒細胞吞噬，中性粒細胞發揮吞噬作用時產生的呼吸爆發使DHR123在氧化反應中被還原為具有綠色熒光的若丹明123（rhodamine 123，Rho123），從而成為流式細胞儀的檢測信號。這種方法的檢測結果可同時反映中性粒細胞的吞噬和氧化2種功能，任何一種功能缺陷都將影響檢測結果[16]。

本研究結果顯示，肺炎組和COPD組外周血中性粒細胞氧化吞噬功能均顯著低于正常對照組（P＜0.05），肺炎組與COPD組之間差異無統計學意義（P＞0.05）；COPD組痰液中性粒細胞氧化吞噬功能顯著低于肺炎組（P＜0.05），而CCR1表達顯著高于肺炎組（P＜0.05）。COPD患者CCR1表達升高，可能是COPD患者氣道中中性粒細胞的蓄積較肺炎患者多，但因聚集的中性粒細胞的氧化吞噬功能較差，所以COPD患者相對于肺炎患者更易發生氣道病理性組織損傷。因此，我們推測COPD患者呼吸道中的中性粒細胞由于自身功能缺陷，導致在感染時的趨化作用過度，精確性下降，盡管中性粒細胞數量增多，但清除病原體的能力不足，最終導致中性粒細胞在肺部的病理性蓄積，進而造成組織損傷。

LIU等[17]的研究結果顯示，COPD患者的主要趨化因子受體都含有至少1個酪氨酸硫酸化位點，酪氨酸硫酸化后通過影響信號傳導來影響參與COPD發病的相關細胞，如中性粒細胞。酪氨酸硫酸化位點的發現有助于特應性受體-配體拮抗劑的研發，對COPD的治療有積極的意義。CCR1等趨化因子受體在COPD中起重要作用，深入研究有助于開發用以調節氣道疾病重要事件的特異性受體-配體拮抗劑。GLADUE等[18]的研究結果顯示，COPD等疾病CCR1表達上調，提示CCR1及其配體的拮抗劑或許可作為治療這類疾病的手段。

TLR2和TLR4的主要配體分別是革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌，在細菌和真菌感染中起核心作用[19-20]。VON SCHEELE等[21]的研究結果顯示，COPD患者支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞TLR2表達下調可能與其吞噬功能下降有關。本研究結果顯示，COPD患者痰液中性粒細胞TLR2和TLR4表達與肺炎組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。原因可能是TLR2和TLR4的表達主要與感染的細菌種類有關，肺炎和COPD患者感染的細菌種類相似，故2種受體表達無明顯差異。

綜上所述，COPD患者中性粒細胞基礎代謝異常活躍，是COPD病程持續進展的重要原因。COPD患者痰液中性粒細胞氧化吞噬功能與其表面CCR1表達有關，提示COPD患者氣道中的中性粒細胞的氧化吞噬功能受損，這可能是COPD發病的機制之一。本研究結論為探索以提高中性粒細胞氧化吞噬功能為靶標的控制COPD炎癥的治療策略提供了實驗和理論依據。