2種高通量核酸檢測方法多種呼吸道病原體檢測效能比較

荊紅波， 李 湛， 何 牧， 王彥波， 李 文， 馬紅梅

（北京市順義區疾病預防控制中心微生物檢驗科，北京 101300）

急性呼吸道感染是一種常見的疾病，感染力強、傳播速度快、發病率高。不同病原體呼吸道感染的臨床癥狀極為相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆發時，及時、準確地鑒定致病病原體是臨床診療的關鍵。近年來，核酸檢測技術已經成為快速診斷呼吸道病原體的首選方法，且多重病原體檢測系統也越來越普及，TaqMan微流體芯片（TaqMan array card，TAC）技術作為國內外近幾年研究較多的高通量病原體篩查技術[1-5]，是一種基于384孔微流體卡片中單重定量PCR的微流控技術。本研究采用多重熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和TAC技術檢測急性呼吸道感染病原體，比較2種方法的檢測效能。

1 材料和方法

1.1 研究對象

按照北京市“傳染病監測技術平臺”發熱呼吸道癥候群監測方案病例定義的標準，收集2017年3月—2018年10月北京市順義區醫院發熱門診、呼吸內科門診、急診、兒科門診就診的流感樣和肺炎患者臨床樣本419例。樣本類型主要為上呼吸道咽拭子樣本、下呼吸道灌洗液和痰液樣本。采集后的臨床樣本立即保存于4 ℃冰箱，24 h內送檢，未及時檢測樣本于-70℃保存。樣本每月采集，每周均勻分布。

1.2 核酸提取

痰液樣本采用痰消化液（英國Oxoid公司）消化待用；咽拭子樣本震蕩后直接采用QIAamp viral RNAmini kit（德國QIAGEN公司）提取病原體核酸，核酸提取后-80℃保存。

1.3 多重熒光定量PCR核酸檢測

采用ViiA 7實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）及呼吸道病毒核酸多重聯檢試劑盒、肺炎支原體和肺炎衣原體核酸多重檢測試劑盒、腸道病毒核酸檢測試劑盒（江蘇和創生物科技有限公司）檢測甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、腺病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、冠狀病毒229E型+HKU1型、冠狀病毒NL63型+OC43型、博卡病毒、腸道病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體共18種病原體。

1.4 TAC 檢測

采用軍事醫學科學院自主研發的定制TAC板對同一例臨床樣本進行呼吸道多種病原核酸檢測，可檢測的病原體包括甲型流感病毒、新甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、甲型流感病毒H5亞型、甲型流感病毒H7亞型、甲型流感病毒N9亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、腺病毒、人偏肺病毒、人偏肺病毒A型、人偏肺病毒B型、鼻病毒、冠狀病毒229E型、冠狀病毒HKU1型、冠狀病毒NL63型、冠狀病毒OC43型、博卡病毒、腸道病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、Q熱立克次氏體、嗜肺軍團菌通用型、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、A族鏈球菌、流感嗜血桿菌、結核分枝桿菌、百日咳鮑特菌（包括Ⅰ相和Ⅱ相）等30余種。

按照AgPath-ID one-step RT-PCR kit（美國Applied Biosystems公司）說明書要求配置反應液體系。每個樣本取20 μL的核酸提取液加入到80 μL的預混液中，混合并添加到TAC板上，離心后備用。采用ViiA 7實時熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件：45 ℃ 10 min；95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環。

1.5 結果判定

以出現“S”型擴增曲線且循環閾值（cycle threshold，Ct）≤38為陽性。如果2種方法檢測結果一致，則認為該樣本的檢測結果是正確的。如果2種方法檢測結果不一致，采用單一病原熒光定量PCR試劑盒進行復核，如果復核結果為陽性，確認復核結果并視為最終結果；如果復核結果是陰性，再次使用普通熒光定量PCR復核，確認復核結果并視為最終結果。

1.6 PCR復核

肺炎支原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腸道病毒、副流感病毒3型采用單一病原熒光定量PCR試劑盒（江蘇碩世生物科技有限公司）進行復核。對初次復核結果不一致的樣本采用普通定量PCR擴增測序復核，參照相關文獻設計鼻病毒[6]、腸道病毒[7]、副流感病毒3型[6]、甲型流感病毒[8]、乙型流感病毒[9]引物，采用iCycler PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）進行PCR擴增，擴增產物采用QIAxcel毛細管電泳儀（德國Qiagen公司）進行電泳，根據條帶大小判定結果。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多重熒光RT-PCR檢測結果

419例樣本中有126例陽性，陽性率為30.1%，其中96%（121/126）的陽性樣本為單一病原感染，僅有4%（5例）為混合感染，均為2種病原共感染，分別為：肺炎支原體+鼻病毒（1例）、肺炎支原體+乙型流感病毒（1例）、肺炎支原體+腸道病毒（1例）、乙型流感病毒+鼻病毒（1例）、副流感病毒2型+人偏肺病毒（1例）。

2.2 TAC檢測結果

419例樣本中有117例陽性，陽性率為27.9%。96.6%（113/117）的陽性樣本為單一病毒感染，3.4%（4例）為混合感染。混合感染中有3例為2種病毒混合感染，分別為2例鼻病毒+腸道病毒混合感染和1例副流感病毒2型+人偏肺病毒混合感染，1例鼻病毒+腸道病毒+肺炎支原體三重混合感染。除了病毒病原體外，TAC還能檢測部分細菌。419例樣本中有55例檢出細菌，陽性率為13.1%，其中74.5%（41/55）為單一細菌感染，病原體包括19株金黃色葡萄球菌、7株肺炎鏈球菌、9株肺炎克雷伯菌、2株A族鏈球菌、3株百日咳鮑特菌和1株流感嗜血桿菌，有14株（25.5%）為2種以上細菌混合感染。419例樣本中檢出15例病毒和細菌的混合感染。

2.3 多重熒光定量PCR和TAC 檢測結果比較

419例樣本中有389例（92.8%）2種方法檢測結果一致，其中陽性結果108例，陰性結果281例。僅有30例（7.2%）病毒檢測結果不一致。

在2種方法檢測結果不一致的30例樣本中，復核之后的結果與多重熒光定量PCR一致18例，其中陽性結果16例、陰性結果2例；復核之后的結果與TAC檢測結果一致11例，其中陽性結果9例、陰性結果2例。見表1。

表1 2種方法不一致結果的復核情況

2種方法檢測肺炎衣原體、1型和2型副流感病毒的敏感性和特異性均為100%。多重熒光定量PCR檢測人偏肺病毒的敏感性和特異性均為100%，檢測其他病毒的特異性均超過99%、敏感性均超過80%。TAC檢測腺病毒的敏感性和特異性均為100%，檢測其他病毒的特異性均超過99%，敏感性均為60%～90%。多重熒光定量PCR和TAC檢測呼吸道病毒的敏感性分別為93.4%和87.4%，特異性分別為98.9%和98.9%，陽性預測值分別為97.7%和97.5%，陰性預測值分別為96.9%和94.3%。2種方法比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、表3。

表2 多重熒光定量PCR對單一呼吸道病毒的檢測性能

表3 TAC對單一呼吸道病毒的檢測性能

3 討論

多重熒光定量PCR是目前比較常用的檢測呼吸道病毒的方法，而TAC是國內外近幾年研究較多的一種高通量病原體篩查技術，1次可通過空間分布實現對384個目標的檢測，被廣泛用于呼吸道病毒、腸道細菌、瘧疾和基因表達等研究中[2-5]。KODANI等[10]發現，TAC檢測在呼吸道病原體的敏感性和特異性接近于實時PCR檢測單一病原體的敏感性和特異性。STEENSELS等[11]發現，TAC技術呼吸道病毒的檢出率明顯高于常規的直接熒光抗體呼吸道病毒檢測法。

本研究結果表明，2種方法檢測單一病毒的特異性均接近100%，但TAC技術的檢測敏感性，尤其是檢測副流感病毒3型、乙型流感病毒、鼻病毒和腸道病毒的敏感性低于熒光定量PCR。可能由于TAC技術對所有的反應均采用同一個提取方法、PCR體系和反應條件導致的。而多重PCR可以根據不同病原體優化不同的實驗條件，可能會更敏感地檢測到某些病原體。

在不明原因的呼吸道感染中，細菌和病毒共感染會使病情更為復雜，迫切需要快速、準確地檢測出致病病原體，TAC技術病原譜檢測范圍更為廣泛，能同時對38種病原體進行檢測，包括27種病毒、8種細菌和3種其他非經典微生物。TAC主要基于384孔板上的單重熒光定量PCR，相同的反應體系、相同的反應條件，每個孔的反應體積僅需要3 μL左右。多重熒光定量PCR可對16種病毒和2種其他病原體進行檢測。此方法主要是基于單管多重擴增，將幾種不同病原體的引物集中在同一個管中進行檢測。本研究使用3種試劑盒，如檢測TAC涵蓋的其他病原體，則需要更多的試劑盒。因此相對來說，TAC檢測的病原體種類更多一些，這在疾病監測，特別是暴發疫情的調查中，可以在短時間內完成對多個患者樣本中38種病原體的檢測，尤其可以快速檢測到多種呼吸道病原體共感染的情況。而使用多重熒光定量PCR進行如此多的病原體檢測，需要花費更多的時間，也增加了檢測成本。因此，當呼吸道疾病的病因未知或懷疑多種病原體共同感染時，TAC技術是實現快速篩查的有效方法。

本研究對2種方法的操作簡便性和時效性進行了比較，2種方法樣本處理及核酸提取的過程相同，結果判讀都是依據Ct值。TAC技術1次能同時檢測38種病原體，但每次只能檢測8個樣本；多重熒光定量PCR 1次能同時檢測18種病原體，但每次最多檢測18個樣本。操作步驟方面，TAC技術操作簡便，僅需一步操作即可完成；而多重熒光定量PCR需要配置多個試劑盒，需要手工操作的步驟比較多。儀器要求方面，TAC技術完成所有病原體的檢測僅需要1臺熒光定量PCR儀，1.5～2 h即可完成，但如果同時檢測多個病原體需要的時間也會相應增加；多重熒光定量PCR需要2臺熒光定量PCR儀，2.5～3 h完成，如果需要進行更多的病原體檢測，也需要更多的時間或更多的儀器。因此，在實際應用中，可根據實際情況來選擇合適的方法。

本研究因未找到相應的呼吸道細菌檢測試劑盒，僅比較了2種方法在多種呼吸道病毒和2種其他病原體檢測方面的性能，沒有比較呼吸道細菌檢測的性能，具有一定的局限性。本研究結果顯示，TAC技術對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的檢出率較高，與國外報道[6]相似。雖然尚不清楚是否與疾病相關，但國外有報道肺炎鏈球菌在病例組和正常對照組中都能被檢測到，且檢出率相近，是否是引起疾病的原因尚待進一步分析[12]。本研究檢出3例百日咳鮑特菌感染病例，且得到了臨床的證實，并根據檢測結果及時控制了病情。

綜上所述，TAC技術與多重熒光定量PCR常見呼吸道病毒檢測的敏感性和特異性相近，但TAC技術病原譜的檢測范圍更廣，在緊急情況下可作為快速篩查多種呼吸道病原體的有效方法。