川芎嗪通過激活VEGF介導的PI3K/ AKT信號通路緩解大鼠腦缺血再灌注引起的損傷

朱百科， 王新新， 趙 恒

(1.山東省立第三醫院神經內科， 山東 濟 南 250031 2.山東省濟南市第五人民醫院中西醫結合腦血管科， 山東 濟 南 250000 3.新疆醫科大學附屬中醫醫院神經外科， 新疆 烏魯木齊 830001)

腦缺血再灌注損傷是腦供血中斷后，重新恢復大腦供血所引起腦損加重的臨危現象，是患者致殘率和病死率增加的主要原因之一，僅次于癌癥和心臟疾病[1]。因此，發現減輕腦缺血再灌注損傷的藥物對于臨床具有重要意義，腦缺血再灌注損傷的發病機理較為復雜，具體機制依然不太清晰。目前研究表明腦缺血再灌注損傷的機制可能是由于腦供血中斷后，引起腦組織細胞缺血、缺氧，誘發炎癥、神經元凋亡及氧化應激、自噬等，進而導致腦供血恢復后進一步誘發炎癥反應、細胞凋亡及氧化自由基的發生[2]。因此，抑制炎癥、神經元凋亡對于治療腦缺血再灌注損傷具有重要意義。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是從川芎根莖中提取的生物堿類化合物，其具有抗血小板聚集、擴張血管、降低心肌耗氧、保護腎臟、抗癲癇等多種作用[3]。同時，據研究報道川芎嗪對于大鼠心肌缺血再灌注具有一定的保護作用[4]。但是，川芎嗪對腦缺血再灌注損傷的作用研究較少，因此，本研究采用大鼠構建腦缺血再灌注損傷模型，探討了川芎嗪對腦缺血再灌注損傷的作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1試藥:川芎嗪購自中國藥品生物制品檢定所(批號：110817-200305)；IL-6、MCP-1、TNF-α ELISA大鼠試劑盒(達科為，中國)；尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，中國)；抗-VEGF、AKT、p-AKT、PI3K、GAPDH(CST，美國)；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(碧云天，中國)；HRP標記山羊抗兔IG、HRP標記山羊抗鼠IG(Abcam，英國)。

1.2實驗動物分組給藥與模型建立:將220～250g雄性成年SD大鼠(新疆醫科大學動物實驗中心提供)60只隨機分為假手術組(C組)、模型組(M組)、川芎嗪低劑量組(L組)、中劑量(I組)、高劑量組(H組)及陽性藥組(P組)，n=10，術前30min，川芎嗪組大鼠靜脈注射川芎嗪(L組：5mg/kg；I組：10mg/kg；H組：30mg/kg)，假手術組(C組)和模型組(M組)均給予等體積的生理鹽水，陽性藥組靜脈注射尼莫地平(1.0mg/kg)。采用改進的Nagasawa栓線法制備腦缺血再灌注模型，閉塞左側大腦中動脈，造成左側大腦半球的局灶性腦缺血，缺血1h后，從頸動脈抽搐拴線即形成再灌注損傷。

1.3神經癥狀評分:在術后24h，采用Longa評分標準檢測神經癥狀，標準：正常，無神經損傷癥狀(0分)；不能完全伸展對側前爪(1分)；不能伸展對側前爪(2分)；向外側輕微轉圈(3分)；嚴重轉圈(4分)；不能行走(5分)，由不知情的實驗員觀察評分。

1.4腦梗死體積和含水量檢測:大鼠腦缺血再灌注24后，迅速斷頭取腦，液氮速凍30min，去除嗅球、小腦和低位腦干，腦組織從額極向后做連續冠狀切成5片，置于37℃，在2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染料中溫育30min，染色結果為正常組織紅色，梗死組織變白色。去除嗅球、小腦和低位腦干后，稱取大腦濕重量，107℃烘烤72h稱干質量，腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量*100%。

1.5HE染色:將大鼠深麻醉，然后在缺血再灌注損傷后24h先后用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注。將腦取出并在4%多聚甲醛中固定24h，然后石蠟包埋。在切片機上切成4μm切片，二甲苯脫蠟，酒精脫水。然后，蘇木精染色3min，曙紅染色1min。最后，在光學顯微鏡下觀察切片，以評估缺血皮層半影中的腦損傷，石蠟切片用于后續實驗。

1.6尼氏染色:將石蠟切片二甲苯中脫蠟，以70%，75%，90%，95%和100%的乙醇水溶液進行脫水。將切片在37℃下用硫氨酸染色1h。在顯微鏡觀察大腦皮層的細胞形態，以評估腦損傷。存活的神經元的數量由觀察者在不了解實驗的情況下進行量化。

1.7TUNEL染色:按照標準的組織化學程序，按照制造商的說明使用原位細胞死亡檢測試劑盒進行TUNEL測定，以確定大腦皮層中TUNEL陽性細胞的密度。凋亡指數(AI)是100個細胞核中的細胞凋亡核數。AI=(TUNEL陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.8RT-PCR檢測:分離和收集實驗大鼠的腦組織，稱取約50mg，加入1mLTrizol，組織研磨儀勻漿，提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer檢測RNA的濃度和純度，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser(寶日醫生物技術有限公司，日本)將RNA(1 μg)逆轉錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(諾唯贊，中國)的CFX Connect Real-Time系統(BioRad，美國)進行qRT-PCR定量分析，擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃延伸30s，重復40個循環，最后根據2-ΔΔCt法計算IL-6、MCP-1、TNF-α、GAPDH mRNA的表達水平。TNF-α Forward：5'-GCCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'；TNF-α Reverse：5'-GAAGGCAGCCCTGGTAACC-3'；IL-6 Forward：5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3'；IL-6 Reverse：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3'；MCP-1 Forward：5'-TCTCGCCCAGGGAGTGCAAAGAGAG-3'；MCP-1 Reverse：TATCGCCAAGGGAACATCTCGAAGCG-3'；GAPDH Forward：5'- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT - 3'；GAPDH Reverse：5'- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG - 3'。

1.9ELISA檢測:采用ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的分泌水平，大鼠腹主動脈取血，用1.5mL EP管收集血液，室溫靜置30min，3000r/min離心15min，收集上清，根據制造商的說明采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.10蛋白免疫印跡(Western blot):分離收集實驗大鼠的腦組織，稱取約30 mg，加入1mL蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，采用Western Blot檢測腦組織VEGF、AKT、p-AKT、PI3K蛋白表達水平。根據制造商說明操作提取組織總蛋白，采用BCA法(碧云天，中國)進行蛋白定量，加入Loading buffer(4X)于100℃煮沸5min，然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳條件：80V，30min；120V，60min。隨后采用100V，90min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國)，用5% BSA室溫封閉60min，TBST洗滌5次，5min/次，用一抗(VEGF、AKT、p-AKT、PI3K及GAPDH，按1∶1000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5min/次，用二抗(HRP標記山羊抗兔IG和HRP標記山羊抗鼠IG，按1∶10000稀釋)室溫孵育90min，TBST洗滌5次，5min/次，用ECL化學發光法(Millipore，MA)顯影檢測，ImageJ分析灰度值。

2 結 果

2.1川芎嗪(TMP)對大鼠神經癥狀、腦梗體積及腦含水量的影響:腦梗體積結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.05)，與模型組(M組)相比，術前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠腦梗死體積(P<0.05)，見圖1A和B。神經功能缺損評分結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠的神經功能缺損評分顯著增加(P<0.05)，與模型組(M組)相比，術前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠的神經功能缺損(P<0.05)，見圖1C。腦含水量結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦含水量顯著增加(P<0.05)，術前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠腦含水量(P<0.05)，見圖1D。

圖1 川芎嗪(TMP)對大鼠神經癥狀、腦梗面積及腦含水量的影響

C：對照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦梗體積(紅色：正常組織；白色：梗死組織)；B大鼠腦梗體積半定量統計；C大鼠神經功能評分；D大鼠腦含水量(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2川芎嗪(TMP)對大鼠血清中炎癥因子表達的影響:采用ELISA檢測大鼠血清中炎癥因子IL-6、MCP-1、TNF-α表達水平，結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α含量顯著增加，術前靜脈注射川芎嗪能夠顯著降低大鼠血清IL-6、MCP-1、TNF-α含量(P<0.05)，見圖2。

圖2 川芎嗪(TMP)對大鼠血清炎癥因子含量的影響

C：對照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠血清IL-6水平；B大鼠血清MCP-1水平；C大鼠血清TNF-α水平(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.3川芎嗪(TMP)對大鼠腦組織病理學的影響:采用病理學檢查進一步研究了川芎嗪對腦缺血再灌注損傷的影響，HE結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠細胞核濃縮，受損細胞比例高達90%，術前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性減少腦組織受損細胞比例，見圖3A和B。尼氏染色結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)神經元密度顯著降低，尼氏體水平顯著下降，術前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性增加尼氏體數量，顯著增加神經元數目(P<0.05)，見圖3A和C。TUNEL染色結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)TUNEL陽性細胞數顯著增加，術前靜脈注射川芎嗪呈劑量依賴性減少凋亡細胞比例(P<0.05)，見圖3A和D。

圖3 川芎嗪(TMP)對大鼠腦組織病理學的影響

C：對照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦組織病理學染色(HE，尼氏和TUNEL染色)；B大鼠腦組織HE染色定量統計；C大鼠腦組織尼氏染色定量統計；D大鼠腦組織TUNEL染色定量統計(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，**P<0.01，***P<0.001)

2.4川芎嗪(TMP)對腦組織炎癥因子表達的影響:采用RT-PCR法檢測大鼠腦組織炎癥因子IL-6、MCP-1、TNF-α表達水平，結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦組織IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA表達水平顯著上調，川芎嗪呈劑量依賴性下調大鼠腦組織IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA表達水平(P<0.05)，見圖4。

圖4 川芎嗪(TMP)對大鼠腦組織炎癥因子表達的影響

C：對照組；M：模型組；L：川芎嗪低劑量組；I：中劑量組；H：高劑量組；P：陽性藥組

A大鼠腦組織IL-6 mRNA表達水平；B大鼠腦組織MCP-1 mRNA表達水平；C大鼠腦組織TNF-α mRNA表達水平(與C組相比，###P<0.001；與M組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.5川芎嗪(TMP)對腦組織VEGF介導的PI3K-AKT信號通路活化的影響:采用Western blot法檢測大鼠腦組織VEGF-PI3K-AKT信號通路蛋白分子的表達水平，結果表明與對照組(C組)相比，模型組(M組)大鼠腦組織VEGF、PI3K、p-AKT/AKT表達水平差異無統計學意義，靜脈注射川芎嗪顯著上調VEGF、PI3K、p-AKT/AKT的表達水平(P<0.05)，見圖5。

圖5 川芎嗪(TMP)對大鼠腦組織VEGF介導的PI3K-AKT信號通路活化的影響

C：對照組；M：模型組；H：高劑量組；P：陽性藥組(與M組相比，**P<0.01，***P<0.001)

3 討 論

川芎嗪(TMP)是從傘形科植物川芎根莖中提取的有效生物堿單體成分，其具有活血行氣、化瘀止痛等功效。現代藥理學研究表明其具有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善循環、抗氧化、抗纖維化及細胞凋亡等多種作用。研究表明川芎嗪對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，但是其對急性腦梗死大鼠缺血再灌注損傷的作用研究較少[4]。因此，本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型評價了川芎嗪對腦缺血再灌注損傷的保護作用及相關分子機制。本研究表明與C組相比，M組大鼠出現腦水腫、腦梗死體積增加及神經功能癥狀損害嚴重等癥狀(P<0.05)，預先靜脈注射川芎嗪(L組，I組，H組)呈劑量依賴性性緩解大鼠腦缺血再灌注引起的腦水腫、腦梗死及神經功能損傷等病理癥狀(P<0.05)，且H組的效果與尼莫地平(P組)相當(P>0.05)，尼莫地平是本研究使用的陽性對照藥這表明本研究首先成功建立了腦缺血再灌注損傷大鼠模型，同時表明川芎嗪對腦缺血再灌注損傷具有潛在的預防作用。

腦缺血再灌注損傷的病理機制復雜，目前依然不太清晰，研究表明炎癥、凋亡、氧化應激等與腦缺血再灌注損傷的病理發生密切相關。特別是腦缺血再灌注引起腦水腫的形成可加重神經功能的損壞，炎癥在腦缺血后腦水腫形成過程中起著至關重要的作用[5]。腦缺血過程中會產生大量的炎癥介質，如促炎因子或趨化因子等，其抑制或缺乏對于預防腦缺血再灌注損傷具有重要意義[6,7]。在本研究結果表明與C組相比，M組大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的水平顯著上調(P<0.05)，同時，與M組相比較，L組，I組，H組大鼠血清中IL-6、MCP-1、TNF-α的水平顯著下調(P<0.05)，且H組與P組效果相當(P>0.05)，上述表明靜脈注射川芎嗪大鼠呈劑量依賴性抑制腦缺血再灌注損傷引起的IL-6、MCP-1、TNF-α產生，其高劑量組與尼莫地平的藥效并無統計學差異。同時，川芎嗪對腦缺血再灌注損傷引起的神經元凋亡具有一定的緩解作用，這表明川芎嗪對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，且這種作用與抗炎和保護神經元相關。

血管內皮生長因子(VEGF)，一種內皮細胞強力絲裂劑，能夠促進內皮細胞的生長，在神經保護作用過程中起著至關重要的作用[8]。研究表明腦缺血后使用外源性VEGF能夠減少腦梗死體積和改善神經功能，并且VEGF能夠促進神經元生長和內皮血管的生成[9,10]。本研究表明與C組相比，M組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達顯著上調(P<0.05)，與M組相比，H組和P組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達顯著下調(P<0.05)，同時H組與P組間無統計學差異(P>0.05)，這表明川芎嗪對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與腦組織VEGF上調有關。正磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，AKT)在信號轉導通路中起著至關重要作用，PI3K/AKT信號通路對血管生成相關轉錄因子和基因表達具有重要調節作用[11]。研究表明VEGF主要通過下游PI3K/AKT信號通路調節內皮細胞增殖、分化及凋亡過程[12]。因此，本研究推測川芎嗪能夠活化PI3K/AKT信號通路減少腦梗死體積及腦水腫，并且促進神經元生長和抑制神經元凋亡，產生保護作用。同時，本研究結果支持了上述觀點，結果表明與C組相比，M組大鼠腦組織中PI3K、p-AKT/AKT表達無統計學差異(P>0.05)，但是與M組相比，H組和P組大鼠腦組織中PI3K、p-AKT/AKT表達顯著上調(P<0.05)，這表明靜脈注射川芎嗪能夠促進腦組織PI3K、p-AKT/AKT表達，活化PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，本研究表明川芎嗪對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，并且這種作用可能與激活VEGF介導的PI3K/AKT信號通路有關。但是，川芎嗪是直接作用于VEGF分子或者間接作用于其他的信號通路仍然不清楚，尚需進一步深入探討。