大蒜素對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響及機制研究

熊 文, 魏 文

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院， 湖北 恩施 445000 2.江漢大學醫學院， 湖北 武漢 430056)

隨著我國經濟的快速發展及國民生活方式的深刻變化，我國心腦血管疾病的發病人數也持續增加[1]。雖然近年來血管介入技術在心腦血管疾病治療中的普及挽救了大量患者的生命，但介入術后的血管再狹窄問題也一直影響著患者術后療效[2]。眾所周知，血管平滑肌細胞的過度增殖以及局部炎癥反應的激活是導致血管再狹窄的重要原因。大蒜素是從大蒜中提取的活性成分，具有多種生物學活性。研究發現大蒜素可抑制多種腫瘤細胞的增殖，且發揮作用與其影響炎癥反應密切相關[3]。同時大蒜素對血管平滑肌細胞鈣電流具有一定的影響，但目前為止關于大蒜素對血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制研究卻少有報道。因此，本研究通過體外培養VSMCs，并使用血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)刺激VSMCs增殖，觀察了大蒜素對VSMCs增殖的作用以及對NF-κB信號通路介導的炎癥反應的影響，從而為血管再狹窄治療尋找潛在的藥物。

1 材料與方法

1.1材料:SD雄性大鼠(120～150g)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大蒜素購自美國Sigma生物公司；血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)購自美國R&D公司；DMEM/F12培養基及1×磷酸鹽緩沖液均購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；CCK-8細胞毒性及增殖檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學研究所；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、脂多糖(LPS)、辣根過氧化物酶(HRP)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均購自上海碧云天生物公司；核轉錄因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65(P-p65)一抗均購自美國CST公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2方 法

1.2.1大鼠胸主動脈平滑肌細胞的分離培養和鑒定:根據文獻[4]中所述，獲取并培養大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，用大鼠α-SM-actin抗體進行免疫熒光染色鑒定VSMCs。將細胞純度達到95%以上的第3～5代血管平滑肌細胞用于后續實驗。

1.2.2實驗分組:將實驗共分為4組：對照組(A組)、PDGF-BB刺激組(B組)、PDGF-BB+大蒜素處理組(C組)、PDGF-BB+大蒜素+脂多糖處理組(D組)。

1.2.3CCK-8實驗:根據文獻[5]中所述，步驟如下：①細胞活性檢測：將血管平滑肌細胞從培養皿上消化下來后，以2.0×104個/孔接種在96孔板中。培養24h后待細胞生長融合至底壁80%時，將培養基更換為無血清培養基進行饑餓處理24h，然后再將細胞與含不同濃度(4,8,16,32,64和128μmoL/L)的大蒜素素或0.1%的DMSO的培養基共孵育24h，向每孔加入10μL CCK-8試劑繼續培養2h后，在酶標儀上(450nm)測各孔的光密度(OD)值。②細胞增殖檢測：將4組細胞按2.0×104個/孔接種于96孔板中，待血管平滑肌細胞融合至培養板底壁50%～60%，將培養基更換為無血清培養基饑餓處理24h后，然后向A組中加入含1%FBS的培養基，其余3組在加入1%FBS的基礎上，分別向B組中加入PDF-BB刺激、向C組中加入PDGF-BB和大蒜素刺激、向D組中加入PDGF-BB和大蒜素及脂多糖刺激，24h后向每孔加入10uL CCK-8試劑繼續培養2h后，在酶標儀上(450nm)測各孔的OD值。每組設6個復孔。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期:將細胞接種于6cm培養皿中，待細胞融合至60%左右時，饑餓處理24h。后將各組培養基更換為含PDGF-BB和/或相應濃度大蒜素及脂多糖的1% FBS的培養基，繼續培養24h。接著用胰酶將細胞消化下來并在水平離心機中以1000轉/min的轉速離心，然后使用預冷的PBS將細胞洗滌2次后，在渦旋儀上邊渦旋邊加入預冷的70%的乙醇固定細胞，然后放置4℃過夜。取出細胞離心并用PBS洗滌細胞2次，然后加入0.4mL PI稀釋液(含50mg/L的PI和100mg/L的RNase A)室溫避光孵育30min，然后使用流式細胞儀(Becton Dickinson, USA)檢測各組細胞周期分布情況，實驗重復3次。計算S期分數和細胞增殖指數。S期分數(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。細胞增殖指數(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達:各組細胞按條件培養完成后，棄去培養上清液后，使用預冷的PBS清洗3遍，然后使用預冷細胞裂解液裂解細胞以獲得蛋白，然后通過BCA蛋白濃度測定試劑盒根據說明書操作測定各組蛋白濃度，然后向各組蛋白中加入上樣緩沖液煮沸后備用。然后將蛋白加入10%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。電泳完成后進行電轉并進行封閉。然后根據指示條帶將目的條帶裁剪后分別與對應的一抗(NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、GAPDH)于4℃水平搖床中孵育18h以上。然后將不同分子蛋白條帶取出后放入PBST中在水平搖床上洗滌3次，每次5min，然后將條帶與HRP二抗室溫孵育1～2h。取出條帶放入PBST中在水平搖床上洗滌3次，每次5min，然后將蛋白面朝上放入化學發光成像系統，打開Image Lab成像系統(BIO-RAD，美國)拍取圖像，通過軟件測定各種目的蛋白條帶灰度值及對應的內參GAPDH的灰度值，然后進行半定量分析。

1.2.6ELISA法測定培養上清液中TNF-α、IL-1β含量:各組細胞經PDGF-BB和/或大蒜素及脂多糖處理24h后，收集各組細胞培養液后離心去除細胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，計算出樣品中對應的濃度。實驗重復3次。

2 結 果

2.1大蒜素對VSMCs活性的影響:CCK-8結果(圖1)顯示，大蒜素濃度高于或等于64μmoL/L時，大蒜素可顯著抑制VSMCs活性(P<0.05)；而當大蒜素濃度低于64μmoL/L后，大蒜素對VSMCs活性無明顯影響(P>0.05)，故本實驗選取的大蒜素濃度為32μmoL/L。

表1 各組血管平滑肌細胞S期分數和細胞增殖指數

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

圖1 大蒜素對大鼠血管平滑肌細胞活性的影響

注：與DMSO組比較，**P<0.01；n=6

2.2大蒜素對VSMCs增殖的影響:CCK-8實驗檢測各組細胞增殖情況(圖2)顯示，與A組比較，B組VSMCs增殖活性增強1.25倍；與B組比較C組VSMCs增殖活性降低47.75%；而與C組比較，D組VSMCs增殖活性增強38.01%(P均<0.05)。

圖2 大蒜素對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01；與C組比較，&&P<0.01；n=6

流式細胞周期檢測結果如表1所示，與A組比較，B組細胞經PDGF-BB刺激后S期分數和細胞增殖指數分別升高1.37倍和0.98倍(P均<0.05)，提示PDGF-BB刺激后細胞周期進展加快，細胞增殖能力增強。然而與B組比較，C組加入大蒜素處理后，S期分數和細胞增殖指數分別降低44.1%和44.2%(P均<0.05)，表明細胞周期阻滯，細胞增殖能力減弱。而與C組比較，D組加入脂多糖刺激后，S期分數和細胞增殖指數分別升高56.7%和52.0%(P均<0.05)，細胞周期進展較C組加快，細胞增殖活性增強。

2.3大蒜素抑制VSMCs中P-p65表達:Western blot結果顯示(圖3)，與A組比較，B組磷酸化p65與總的p65比值(P-p65/p65)提高2.79倍(P<0.05)；而與B組比較，C組P-p65/p65顯著降低近58.0%(P<0.05)。與C組比較，D組P-p65/p65增加64.8%(P<0.05)。另外，各組間總的NF-κB p65水平未見統計學差異(P>0.05)。

圖3 大蒜素對血管平滑肌細胞內核轉錄因子κB p65的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

2.4大蒜素抑制VSMCs中TNF-α、IL-1β表達 ELISA結果(圖4)顯示，與A組比較，PDGF-BB刺激后培養上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別增加1.80倍和2.75倍(P均<0.05)；而與B組比較，C組培養上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別降低44.4%和45.8%(P均<0.05)。另外，與C組比較，D組培養上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別增加28.1%和39.9%(P均<0.05)。以上結果提示，大蒜素可抑制PDGF-BB誘導的炎癥相關因子的表達。

圖4 大蒜素對血管平滑肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β表達的影響

注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01；與C組比較，&P<0.05；n=3

3 討 論

VSMCs過度增殖是引起血管再狹窄發生的重要原因之一。基于血管成形術以及支架植入術在內的介入操作及原發疾病引起的血管內膜損傷，可引起血液中白細胞、血小板及脂質顆粒等聚集并產生炎癥反應；與此同時，聚集的血小板、炎癥細胞等分泌細胞生長因子和炎癥因子等介質，而這些介質可誘導VSMCs由靜止的收縮型向活躍的合成型轉變，從而引起血管內膜過度增殖并遷移至內膜，最終導致血管狹窄的發生。由此可見，對血管內膜過度增殖及炎癥反應進行干預，可有效減少血管再狹窄的發生。

大蒜素是大蒜的主要活性物質，具有抗氧化，抗腫瘤及防治心肌纖維化等多種功效。在阿霉素誘導的大鼠心臟毒性模型中，大蒜素可抑制NF-κB蛋白表達或核轉位，并降低大鼠血清中炎癥因子(包括IL-1β和TNF-α)水平顯示出抗炎作用[6]。研究表明，包括IL-1β和TNF-α等在內的炎癥因子對VSMCs增殖具有促進作用；抑制NF-κB信號通路激活，可通過降低下游炎癥因子的表達而對血管平滑肌細胞增殖起到抑制作用，從而減少血管損傷后新生內膜的形成[7]。最新研究也顯示，LPS作為NF-κB信號通路的一種激活劑，它可通過誘導NF-κB信號通路的激活對血管平滑肌細胞增殖和遷移起到促進作用[8]。與之前研究相似，本研究中發現大蒜素可顯著抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖。進一步機制研究發現大蒜素可明顯抑制VSMCs內NF-κB p65蛋白的磷酸化，以及降低了NF-κB信號通路下游的包括TNF-α、IL-1β在內的炎癥因子的水平；而加用NF-κB信號通路激活劑LPS刺激后，可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，同時NF-κB p65蛋白的磷酸化水平、IL-1β、TNF-α濃度均有所上升。

PDGF-BB是一種重要的促有絲分裂因子，可以通過激活細胞內多種信號通路促進細胞分裂增殖。有研究顯示，PDGF-BB在血管損傷后的新生血管內膜增生中具有促進作用，其可誘導VSMCs增殖并向內膜遷移[9]。因此，PDGF-BB常被用來作為細胞增殖模型的誘導劑使用。我們的數據也顯示，體外培養的VMSCs經PDGF-BB刺激后，其增殖能力顯著增強。LPS可作為NF-κB信號通路的激活劑，其可通過增強NF-κB信號通路的激活，增強炎癥因子表達，本實驗顯示其可削弱大蒜素抑制VSMCs增殖的能力，這為進一步確定大蒜素發揮作用的機制與其抑制NF-κB信號通路之間的關系提供了可靠的依據。

總之，我們的實驗結果表明，大蒜素可顯著抑制PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞的增殖，而發揮作用的機制與抑制NF-κB信號通路激活及減弱炎癥反應有關。