lncRNA MRAK048635_P1對血管平滑肌細胞miRNA的調控作用

方根強 祁 佳 黃黎亞 趙仙先 陳書艷

高血壓是心腦血管疾病最重要的危險因素。血壓持續升高導致的血管重塑和血管功能障礙是造成心腦血管疾病患者死亡的重要原因。血管重塑是由于血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cell，VSMC)的異常增殖、遷移和侵襲所引起的[1，2]。長度>200nt的長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一類重要的非編碼轉錄本[3]。lncRNA可以在轉錄和轉錄后水平調節靶基因的表達，并廣泛參與眾多生物學過程[4]。最近的研究顯示，lncRNA在心血管疾病中也起著至關重要的作用。Kumarswamy等[5]研究發現lncRNA uc022bqs.1在心力衰竭患者中的表達水平明顯增加，并且與心血管死亡的風險呈正相關。研究發現lncRNA MALAT1與糖尿病引起的微血管功能障礙密切相關[6]。Chen等[7]報道lncRNA NR_104181高表達和NR_027032低表達可能與高血壓風險有關。

lncRNA可作為一種競爭性內源性RNA (competitive endogenous RNA，ceRNA)與microRNAs (miRNAs)相互作用，參與調控靶基因的表達。在這一過程中，lncRNA通過應答元件 (miRNAs response element，MRE)競爭性地結合具有相同MRE的miRNAs從而參與靶基因的表達調控[8，9]。另外,再狹窄 (restenosis)主要是由于血管中VSMC過度增殖所致。Lv等[10]研究發現lncRNA H19來源的miR-675通過靶向原癌基因PTEN加重血管再狹窄。另外，Tian等[11]研究發現lncRNA UCA1能夠通過抑制miR-26a調控VSMC的增殖和遷移能力。總之，越來越多的證據顯示lncRNAs和miRNAs與心腦血管疾病的發生和發展密切相關。因此，準確預測lncRNA的靶miRNAs并對其靶基因進行系統的生物學分析是研究其作用機制的重要環節，而生物信息學工具可以快速有效地提供靶基因預測、基因測序和調控網絡構建等方面數據。

為了探究lncRNA在高血壓病VSMC中的生物學作用，Yao等[12]利用基因芯片篩選自發性高血壓大鼠 (spontaneously hypertensive rats，SHR)和Wistar-Kyoto大鼠 (WKY)的主動脈中VSMC的lncRNA表達譜，結果顯示68個lncRNAs被上調，而167個lncRNAs在SHR的主動脈中被下調。研究表明，lncRNA MRAK048635_P1可在Wistar-Kyoto大鼠中出現明顯的表達量變化[13]。本團隊前期研究結果表明，lncRNA MRAK048635_P1水平的降低可能是高血壓血管重構的重要因素，調節vsmc功能和表型，降低MRAK048635_P1可能是治療原發性高血壓的一個潛在靶點[14]。在筆者前期研究中為了進一步探討MRAK048635_P1潛在的機制功能，嘗試預測可能與MRAK048635_P1相互作用的miRNAs,但未獲得相關結果。同時，筆者也注意到SHR中MRAK048635_P1的表達水平與WKY比較存在顯著差異，說明MRAK048635_P1在大鼠自發性高血壓中參與對VSMC的調節。本研究以MRAK048635_P1為切入點，系統分析了其參與調控的miRNAs及相應靶基因，用以探討MRAK048635_P1與高血壓發病機制間的相關性。

材料與方法

1.實驗動物和VSMC的制備: 實驗用大鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005。VSMC分離自正常大鼠主動脈，具體方法參考文獻[15]。所有動物實驗均遵循實驗室動物保護原則。siMRAK048635_P1和對照組siRNA質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，并使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (13-778-075，美國Invitrogen公司)轉染。miR-122-5p inhibitor以及miR-122-5p inhibitor negative control (NC)質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

2.差異miRNAs聚類分析： 實驗動物分為空白組、NC組、siRNA1組、siRNA2組 、siRNA3組進行差異miRNAs聚類分析。差異miRNAs聚類分析用于判斷不同實驗條件下差異miRNAs表達量的聚類模式。根據miRNAs的表達量進行的聚類，通過log10 (TPM+1)進行計算，是為了判斷不同實驗條件下差異miRNAs表達量的聚類模式。聚類使用的為R軟件中的聚類軟件包pheatmap，所針對的數據為union_for_cluster (差異miRNAs的并集)，以miRNAs的相對表達水平值log2 (ratios) 進行聚類。其采用相應的距離算法，算出每個miRNAs之間的距離,然后通過反復迭代，計算miRNAs之間的相對距離,最后根據miRNAs的相對距離遠近分成不同的subcluster，從而實現聚類。

3.GO富集分析: GO分析方法為GOseq，此方法基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution，相對于普通的Hyper-geometric distribution，此分布的特點是從某個類別中抽取個體的概率與從某個類別之外抽取一個個體的概率是不同的，這種概率的不同是通過對基因長度的偏好性進行估計得到的，從而能更為準確地計算出GO term被候選靶基因富集的概率[16]。本研究中筆者針對細胞組分、分子功能和生物學過程進行富集分析。

4.KEGG通路富集分析: 通路顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景比較，在候選靶基因中顯著性富集的Pathway。用BH的方法對P值進行校正，得到的校正后的P值越小代表越顯著。這里將P<0.05的通路定義為在候選靶基因中顯著富集的通路。

5.qRT-PCR:VSMC分別轉染Scr siRNA和siMRAK048635_P1， 檢測Scr siRNA組和siMRAK048635_P1組VSMC中MRAK048635_P1、miR-122-5p和Gper1的表達；同時檢測miR-122-5p inhibitor組和miR-122-5p inhibitor negative(NC)組VSMC中miR-122-5p和Gper1的表達。使用Trizol(美國Invitrogen公司)提取大鼠VSMC中總RNA，反轉錄成cDNA(瑞士Biotool公司，B24403)，然后進行qRT-PCR(瑞士Biotool公司，B21202)。Gper1上游引物為：5′-GGACAACTTACTGATGCTAGGG-3′；下游引物為：5′-CGGTGCAGCTGGAACAACCGAC-3′。采用20μl PCR反應體系: ddH2O 7μl，上下游引物各0.5μl，PCR Super Master Mix 10μl，cDNA 2μl。qRT-PCR反應條件：95℃ 5min預變性，95℃ 30s變性，55℃ 30s退火、72℃ 30s延伸，共40個循環。采用△△Ct法對實驗結果進行分析。

結 果

1.差異miRNAs聚類分析:在VSMC細胞中，特異性siRNA被用來下調大鼠VSMC中MRAK048635_P1的表達水平 (圖1A)。然后，通過對敲降效果最好的siRNA2干擾前后的VSMC中miRNA進行二代測序，隨后，筆者利用散點圖對miRNAs的表達譜進行了分析，發現大量的miRNAs在NC組和siRNA組之間有差異表達 (圖1B)。層次聚類分析用于判斷各組中差異表達的miRNAs，其結果顯示siRNA介導MRAK048635_P1下調后，共有12個差異表達的miRNAs，其中表達上調的miRNAs分別是miR-122-5p (2.3倍)、miR-122b (2.5倍)、miR-127-3p (3.6倍)、miR-206-3p (3.6倍)、miR-434-5p (7.5倍)，下調的miRNAs分別是miR-1b (2.6倍)、miR-451-5p (3.6倍)、miR-143-3p (1.5倍)、miR-99a-5p (1.9倍)、miR-133a-3p (2.8倍)、miR-133c (2.8倍)和miR-146a-5p (1.0倍) (圖1C)。

圖1 差異miRNAs聚類分析A.在VSMC中，通過qRT-PCR驗證siMRAK048635_P1的干擾效率；B. 散點圖顯示NC組和siRNA組存在表達差異的miRNAs；C. 整體層次聚類圖，以log10 (TPM+1)值進行聚類，紅色表示高表達miRNAs，藍色表示低表達miRNAs

2．靶基因預測及GO分析：利用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件預測的差異表達的miRNAs的靶基因共5066個。筆者對每組差異表達miRNAs的靶基因的集合分別進行GO富集分析(圖2)。橫坐標為GO 3個大類的下一層級的GO term，縱坐標為注釋到該term下的候選靶基因個數及其個數占被注釋上的候選靶基因總數的比例。3種不同分類表示Go term的3種基本分類,從左往右依次為生物學過程、細胞成分、分子功能。結果發現其中302個基因具有GO分子功能注釋信息，其功能主要富集于血管內皮遷移的負調控、心血管系統發育、信號受體活性、核染色質和蛋白結合以及免疫應答等。在查詢GO富集結果中與VSMC相關的基因時，有一個基因G protein-coupled estrogen receptor 1 (Gper1)多次出現。Gper1正是差異表達的miR-122-5p的靶基因。

圖2 候選靶基因GO富集柱狀圖

3.KEGG通路分析：利用KEGG對差異表達miRNAs靶基因集合中的基因進行生物通路富集分析。這些靶基因顯著富集于軸突導向(n=8)、晝夜節律 (n=4)、N-糖基生物合成 (n=5)、內吞蛋白加工 (n=9)、內質網礦物吸收 (n=7)、鞘脂代謝 (n=3)、核糖體生物合成 (n=3)、真核生物單純性皰疹病毒感染 (n=5)、萜類 (n=4)、骨架生物合成 (n=7)、腎素-血管緊張素系統 (n=2)、維生素消化吸收 (n=2)、神經活性 (n=2)、配體-受體相互作用 (n=8)、炎性介質調節 (n=4)、咖啡因代謝 (n=1)、糖酵解及糖異生 (n=3)、果糖及甘露糖代謝(n=2)、脂肪消化吸收 (n=2)及類風濕關節炎(n=3)等相關通路 (P<0.05，圖3)。

圖3 候選靶基因KEGG富集散點圖

4.下調的MRAK048635_P1可能通過促進miR-122-5p來調控Gper1的表達: 筆者通過一系列體外實驗繼續驗證了生物信息學的分析結果。在MRAK048635_P1表達下調的大鼠VSMC中，miR-122-5p的表達水平顯著增強(P<0.05)，而Gper1 mRNA的表達被下調 (P<0.01)。另外，與NC inhibitor組比較，miR-122-5p inhibitor組中的Gper1 mRNA的表達水平顯著增強 (P<0.01，圖4)。

圖4 MRAK048635_P1通過抑制miR-122-5p來調控Gper1的表達 A．轉染Scr siRNA和siMRAK048635_P1的VSMC中MRAK048635_P1、miR-122-5p和Gper1的表達；B．轉染miR-122-5p inhibitor和miR-122-5p inhibitor negative(NC)的VSMC中miR-122-5p和Gper1的表達;C．MRAK048635_P1/miR-122-5p/Gper1 mRNA軸對高血壓疾病潛在的調控機制

討 論

血管損傷、血管重塑和血管生成是導致高血壓并發癥的主要原因[17]。lncRNAs和miRNAs參與了血管內皮細胞和VSMC功能的調控。相關研究提示MRAK048635_P1可能在大鼠自發性高血壓中參與對VSMC功能的調節，因此對MRAK048635_P1進行靶miRNAs預測及其生物學特性分析具有重要意義[18]。

聚類分析用于判斷差異miRNAs在不同實驗條件下的表達模式,將表達模式相同或相近的miRNAs聚集成類,進而識別未知miRNAs的功能或已知miRNAs的未知功能,這些同類miRNAs可能具有相似的功能[19]。本研究通過特異性siRNA下調大鼠VSMC中MRAK048635_P1的表達，通過整體層次聚類分析發現MRAK048635_P1下調后共13個差異表達的miRNAs，其中5個miRNAs的表達被上調，7個表達被下調。成熟的miRNAs與其不完全互補的mRNA的3′UTR結合，在翻譯水平上抑制靶mRNA的表達。另外，miRNAs也有可能影響mRNA的穩定性。接下來，筆者利用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件來預測這些差異表達的miRNAs的靶基因[20]。

GO和KEGG分析被用來研究MRAK048635_P1表達下調后差異表達的miRNAs的靶基因的作用機制。GO是基因功能國際標準分類體系。根據實驗目的選出靶基因后，研究候選靶基因在GO中的分布狀況將闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現。筆者發現差異表達的miRNAs的靶基因主要富集于血管內皮遷移的負調控、心血管系統發育、信號受體活性、核染色質和蛋白結合以及免疫應答等生物學功能中。值得注意的是，GO富集結果顯示，miR-122-5p的靶基因Gper1尚參與調節血管平滑肌的分化。Gper1定位于染色體7p22上，由一條含7次跨膜結構的肽鏈構成，其主要組成包括配體結合結構域、G蛋白結合結構域以及1個Asp-Arg-Tyr三聯體保守序列[21]。Gper1廣泛表達于心臟和動靜脈的VSMC和內皮細胞中，參與對血管中內源性的血管收縮物質 (如血管緊張素Ⅱ)和血管擴張物質如NO的調節作用[22]。相關的機制研究顯示，作為7次跨膜受體，結合外源信號后的GPER可變構激活表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)，進而激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶 (PI3K)，然后，磷脂酰肌醇3磷酸 (PIP3)在細胞膜上聚集并通過其PH結構域激活蛋白激酶B (PKB)，最終催化NO的合成。NO進入VSMC并激活鳥苷酸環化酶 (GC)，GC通過cGMP-PKG通路介導血管松弛[23]。

臨床研究表明，由于Gper1參與了雌激素對血壓的調節，絕經前女性的高血壓發生率明顯低于同齡男性。進一步的機制研究表明，Gper1可能抑制VSMC中Ca2+通道的開放，降低胞內Ca2+的濃度，從而抑制Ca2+-CaM復合物的形成，最終導致非內皮依賴性的血管舒張[24]。結合本課題的研究結果，筆者推斷，在VSMC細胞中，MRAK048635_P1可能通過與miR-122-5p相互作用靶向Gper1，從而參與高血壓疾病的發生。與預測結果相同，本實驗結果初步揭示了一條MRAK048635_P1調控高血壓疾病發生、發展的潛在分子通路，即MRAK048635_P1/miR-122-5/Gper1 mRNA軸 (圖4)。當然，要揭示其中的具體機制仍需要大量的工作，這將是未來研究的重點。

本研究對差異表達miRNAs的靶基因進行KEGG富集。在生物體內，不同基因通過相互協調發揮其生物學功能，通過通路顯著性富集能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。KEGG可對miRNAs諸多靶基因所涉及信號通路進行整合分析。通路顯著性富集分析以KEGG通路為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景比較，在候選靶基因中顯著性富集的通路[25]。本研究中的KEGG通路分析結果顯示，MRAK048635_P1表達下調后差異表達的miRNAs功能顯著富集于軸突導向、晝夜節律、N-糖基生物合成、內吞蛋白加工、內質網礦物吸收、鞘脂代謝和核糖體生物合成等相關通路 (P<0.05)。KEGG結果提示MRAK048635_P1不僅在高血壓疾病中起著重要作用，而且可能參與多種疾病的發生與發展過程，其作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學對VSMC中MRAK048635_P1下調后差異表達的miRNAs進行靶基因預測、GO分析和KEGG信號通路分析，結果顯示MRAK048635_P1可能通過調控多種miRNAs參與信號通路的調節。另外，MRAK048635_P1/miR-122-5/Gper1 mRNA軸可能在高血壓疾病中發揮著重要的作用，是一個頗有研究價值的生物學靶標。