蝴蝶花中2種異黃酮的含量測定及其抗腫瘤活性

楊 倩，鄭 茜，魏 靜，張 春*

（1.西南醫科大學藥學院，四川瀘州646000； 2.四川衛生康復職業學院藥學系，四川自貢643000）

蝴蝶花Iris japonica Thunb.為鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物.其性味苦、寒，有小毒，具有消腫止痛、清熱解毒的功效[1-2]，蝴蝶花在民間應用廣泛，主治肝炎、肝腫大和胃痛等[3].但對其生藥學、質量標準及藥效有效成分等研究較少.近年來，研究發現，蝴蝶花主要含異黃酮類化合物[4-5]和三萜類化合物.其中從乙酸乙酯部位分離得到鳶尾黃素與次野鳶尾黃素為其重要成分[6]，但對蝴蝶花中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素含量的研究未見報道.鳶尾黃素與次野鳶尾黃素具有多種生物活性，目前，對其抗腫瘤活性鮮有研究[7-8].因此，本研究試圖建立不同產地蝴蝶花中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素HPLC含量測定方法，并對蝴蝶花的不同產地和不同部位進行兩種成分的含量測定.同時，采用幾種腫瘤細胞株，對其進行活性檢測.該結果為蝴蝶花質量標準的建立，及其資源的進一步開發利用奠定基礎.

1 材料

Agilent 1260色譜工作儀（安捷倫科技有限公司），MS105DU半微量天平（瑞士梅特勒-托利多集團），Spectra Max M3多功能酶標分析儀（美國Molecular Devices），HERACELL-150i CO2培養箱（Thermo Fisher Scientific），CKX53-SLP 倒置顯微鏡（日本Olympus公司），TG-17多功能高速離心機（德國 Eppendorf公司），Scientific-80℃冰箱（Thermo Fisher Scientific），Milli-Q 純水儀（美國Millipore公司），JOYN-10A型超聲波清洗儀（上海喬躍電子科技有限公司）.

標準品鳶尾黃素（批號：PS161122-01）與次野鳶尾黃素（批號：PS0681-0020）均購自成都普思生物科技股份有限公司，質量分數均＞98.0%.蝴蝶花藥材均采自四川省不同產地，經西南醫科大學稅丕先教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬蝴蝶花的全草.流動相甲醇、乙酸均為色譜純，其他試劑均為分析純.DMEM高糖培養基、1640培養基（Hyclone），PAN胎牛血清（德國PAN-Biotech公司），CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所），Hela細胞、Hccc-9810細胞和H460細胞均購自中國科學院細胞庫（上海）.

2 方法與結果

2.1 蝴蝶花中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18（2）（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；溫度：30 ℃；檢測波長：267 nm；進樣量：10 μL；流動相 A為甲醇，B為體積分數0.05%乙酸水溶液，梯度洗脫條件為：0～10 min：體積分數 55%A；10～20 min：體積分數55% ～57%A；20 ～30 min：體積分數57%～60%A.

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取減壓干燥至恒重的鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對照品適量，置于棕色量瓶中，甲醇溶解，配制成質量濃度0.20 g/L的鳶尾黃素溶液與質量濃度0.25 g/L的次野鳶尾黃素溶液.

2.1.3 供試品溶液的配制 蝴蝶花根莖及葉部位放于減壓干燥箱中，60℃減壓干燥2 h.精密稱取1.0 g蝴蝶花根莖、葉粉末（過100目篩），置于具塞磨口瓶內，加入甲醇50 mL，超聲60 min；趁熱過濾收集濾液，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，即得供試品溶液.

2.1.4 系統適應性實驗 分別精密吸取“2.1.2”和“2.1.3”項下制備的對照品和供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1.對照品鳶尾黃素色譜峰的保留時間為15.167 min，次野鳶尾黃素色譜峰的保留時間為27.395 min.確認根莖樣品和葉樣品中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素的保留時間與對照品溶液一致，分離度均大于1.5，理論塔板數均不低于10 000，溶劑空白無干擾.

圖1 對照品（A）與根莖樣品（B）、葉樣品（C）的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of authentic standards sample（A），sample of rhizoma（B）and sample of leaf（C）

2.1.5 線性關系 分別精準量取鳶尾黃素溶液0.025、0.125、0.25、2.50、5.00 mL，次野鳶尾黃素溶液0.10、0.20、2.00、4.00 mL 置于10 mL 的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，按上述色譜條件進行測定.以對照品質量濃度為橫坐標（mg/mL），峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程分別為：鳶尾黃素：y=43 592x+16.611（r=0.999 6），線性范圍為0.5～100 mg/L；次野鳶尾黃素：y=47 574x+40.349（r=0.999 9），線性范圍為2.5～250 mg/L.

2.1.6 重復性實驗 取瀘州蝴蝶花根莖粉末6份按“2.1.3”項的條件制備供試品，按以上色譜條件進樣，測定峰面積，計算鳶尾黃素、次野鳶尾黃素的RSD%分別為1.15%、0.94%.

2.1.7 穩定性實驗 精密吸取供試液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 按以上色譜條件進樣檢測.鳶尾黃素、次野鳶尾黃素峰面積的 RSD%分別為0.96%、0.52%.

2.1.8 精密度實驗 取鳶尾黃素與次野鳶尾黃素混合對照品溶液按以上色譜條件連續進樣6次，鳶尾黃素、次野鳶尾黃素峰面積的RSD%分別為1.47%、0.75%.

2.1.9 加樣回收實驗 精密吸取已知鳶尾黃素與次野鳶尾黃素含量的蝴蝶花供試品9份，分別按已知質量分數的50%、100%、150%共3個水平加入對照品鳶尾黃素與次野鳶尾黃素，按“2.1.3”項方法制備，按以上條件進樣10 μL測定，計算平均回收率，結果如表1，鳶尾黃素與次野鳶尾黃素的平均回收率分別為99.96%、100.24%；RSD%分別為2.01%、1.49%.

表1 加樣回收實驗Tab.1 Results of the recovery tests

2.1.10 樣品含量測定 精密稱取不同產地蝴蝶花藥材根莖與葉部位粉末，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，測定樣品含量，結果見表2.

2.2 體外抗腫瘤活性研究

2.2.1 細胞培養 人宮頸癌細胞Hela、人大細胞肺癌細胞H460分別培養于含有質量分數10%胎牛血清的RPMI培養液中，人肝內膽管癌細胞Hccc-9810培養于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中.3種細胞均放于37℃體積分數5%的CO2培養箱中常規培養.

2.2.2 CCK-8實驗 精密稱取一定量的鳶尾黃素與次野鳶尾黃素，加入少量二甲基亞砜充分溶解后，再加入適量培養基制備成濃度10 mol/L的母液.取對數生長期細胞并調整細胞懸液密度為5×104個/mL，以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板，于37℃體積分數5%的CO2中常規培養24 h[7].待細胞貼壁后加入一定濃度的待測藥物（陽性對照組加入一定濃度的五氟尿嘧啶，陰性對照組加入質量分數0.1%的DMSO的培養基）與細胞共孵育48 h后，吸出培養基，每孔加入質量分數10%的CCK-8 100 μL置于培養箱中繼續孵育30 min，酶標儀450 nm處測定各孔光密度OD值.按下述公式計算各組抑制率為：

2.2.3 統計分析 所有數據資料均用SPSS 20.0統計軟件分析，用one-way ANOVA進行處理，各組數據資料用?±s表示，以P＜0.05表示差異有統計學意義.

2.2.4 結果 不同濃度的鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對Hela細胞、Hccc-9810細胞和H460細胞的生長均能產生不同程度抑制作用，其抑制作用隨藥物濃度的增加而增加，其中鳶尾黃素對Hela細胞的抑制率最大，如圖2和3所示.鳶尾黃素對Hela細胞的生長抑制的IC50值為（49.24±1.11）μmol/L，與陽性對照五氟尿嘧啶的IC50值（23.72±1.24）比較接近，表明鳶尾黃素對Hela細胞具有很好的抗增值抑制作用.鳶尾黃素對H460細胞的IC50值為（308.4 ±1.29）μmol/L、對 Hccc-9810 細胞的IC50＞360 μmol/L，其 IC50值均遠大于陽性對照的結果.次野鳶尾黃對Hela細胞生長抑制的IC50為（146.9 ±1.23）μmol/L，對其他細胞的 IC50＞360 μmol/L，見表 3.

圖2 不同濃度的鳶尾黃素對Hela、Hccc-9810、H460細胞的抑制率Fig.2 Inhibition rate of different concentrations of tectorigenin on Hela，Hccc-9810 and H460 cells

圖3 不同濃度的次野鳶尾黃素對Hela、Hccc-9810、H460細胞的抑制率Fig.3 Inhibition rate of different concentrations of irisflorentin on Hela，Hccc-9810 and H460 cells

表3 不同濃度的五氟尿嘧啶、鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對3種細胞的IC50Tab.3 IC50values of different concentrations of pentafluorouracil，tectorigenin and irisflorentin on three kinds of cells μmol/L

3 討論

前人采用HPLC法，以乙腈-磷酸水作為流動相，對射干及川射干中鳶尾黃素與次野鳶尾黃素進行含量測定[9-10]，但未見對蝴蝶花中該成分含量測定的報道.張金專等[11]采用乙腈-磷酸水作為流動相，建立了中藥蝴蝶花高效液相指紋圖譜，但該法僅分離出3個峰型較好的峰.本文首次采用HPLC法對蝴蝶花進行鳶尾黃素與次野鳶尾黃素含量測定，采用甲醇-水作為流動相，能分離出6個峰型較好的峰，分離度遠好于采用乙腈-磷酸水作為流動相的結果，且從環境與經濟而言，甲醇優于乙腈.從方法學考察各項指標可看出，本文此方法專屬性強、準確度高、重復性好，可用于蝴蝶花中這兩種異黃酮成分的含量測定，為蝴蝶花質量標準的制定，奠定了實驗基礎.由表2可看出，不同產地蝴蝶花中鳶尾黃素和次野鳶尾黃素含量差異較大，次野鳶尾黃素在廣元和達州分布的材料根中含量甚少（＜2.5 μg）.鳶尾黃素在達州市蝴蝶花的葉中含量最高，次野鳶尾黃素在瀘州蝴蝶花的葉中含量最高.該結果說明，鳶尾黃素和次野鳶尾黃素在蝴蝶花中含量多少，受其產地、環境因素影響較大.此外，在同一植株不同部位，二者含量也有較大差異，表明這兩種異黃酮成分存在明顯的組織特異性.

前人已報道鳶尾黃素對HepG2、Caski腫瘤細胞的抗增殖活性[8]，其能上調人宮頸癌Caski細胞Bax蛋白、下調bcl-2蛋白的表達進而誘導Caski細胞凋亡；次野鳶尾黃素能明顯抑制MDA-MB-231腫瘤細胞的生長[7].本實驗考察鳶尾黃素與次野鳶尾黃素對Hela、H460、Hccc-9810細胞株的抗增殖活性.結果顯示，鳶尾黃素對Hela細胞的抗增值效果最好，其 IC50值為49 μmol/L，但對于 Hccc-9810和H460細胞株則沒有明顯的抑制作用.次野鳶尾黃素對3種腫瘤細胞株的抑制效果均不理想.因此，結合前人研究結果可知，鳶尾黃素和次野鳶尾黃素對腫瘤細胞的抑制作用，僅限于少數幾種腫瘤細胞，其確切的抑制作用機理有待于進一步深入研究.