單菌落效價測定在阿維菌素菌種篩選中的應用研究

程曦 劉麗虹 劉進峰 高亞琪

摘要 ? ?為減少阿維菌素菌種篩選的工作量，縮短篩選時間，提高篩選效率，本文對阿維菌素菌種單菌落效價進行測定，用單菌落效價初步表達菌株的產抗能力，探索固態下單菌落效價與液態下搖瓶效價的相關性。結果表明，阿維菌素菌種固態下產抗能力和液態下產抗能力正關聯，相關系數r=0.924。可以只對菌落效價高的菌株做進一步的搖瓶培養及效價測定，減少篩選工作量，提高篩選效率。

關鍵詞 ? ?阿維菌素菌種;單菌落;篩選;效價測定

中圖分類號 ? ?TQ453 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）12-0129-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

阿維菌素（avermectins，AVMs）是由阿維鏈霉菌（Strept-omyces avermitilis）代謝產生的一種效果極佳的大環內酯類殺螨殺蟲劑和潛在的抗生素藥物[1]。其作用機制獨特，與其他抗寄生蟲藥物無交叉耐藥性，毒性低、無殘留[2]。阿維鏈霉菌發酵液中通常含有8種阿維菌素組分，即A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中B1組分，尤其是B1a組分的殺蟲效果最佳，目前B1a組分也是商品化阿維菌素產品的主要成分[3-4]。在近20年的阿維菌素工業化生產中，通過菌種篩選、發酵配方和控制工藝的不斷優化，發酵水平不斷提高，特別是中國科學院微生物研究所引進合成生物學技術，將阿維菌素單位產量提高1 000倍，至9 g/L[5]。然而，當下阿維菌素的生產中仍然存在生產穩定性差、高消耗、高污染、片面追求生產規模的粗放發展等問題，若要從根本上解決這些問題，就需要對阿維菌素的生產菌種——阿維鏈霉菌進行持續的改良篩選。

誘變篩選是進行阿維鏈霉菌改良的主要方法。阿維鏈霉菌菌株經過誘變處理后，正變異率極低。傳統的篩選方法是根據單菌落外觀（如形狀、顏色）挑選單菌落并進行后續培養及液態下的搖瓶效價測定。該方法存在隨機性強、篩選工作量大以及耗時長等問題。如果測定固態下的單菌落效價，用單菌落效價表達菌株產能，就避免了大量的斜面培養、種子瓶培養和發酵瓶培養操作過程，可以極大地減少工作量，提高篩選效率。采用該方法時需要解決的一個關鍵問題是阿維鏈霉菌在固態發酵產生效價時，其在搖瓶培養中是否產生效價，如果產生，2種情況下效價的關聯程度如何。例如，日本明治制果公司曾從土壤中分離出放線菌，并對其在固態和液態下的產抗能力（即效價）做了相關統計。結果顯示，在將這些固態發酵中有抗菌活性的1 300株菌種，再做液態發酵培養有活性的占1 275株，而25株在液態發酵時變得無抗菌活性[6]。阿維鏈霉菌屬于放線菌的一種，其在固態菌落發酵和液態培養瓶發酵存在一定的差別，目前關于阿維鏈霉菌在固態發酵和液態發酵下所產生效價之間的關聯性尚不明確。

基于上述研究背景，本文對阿維菌素菌種——即阿維鏈霉菌在固態發酵和液態發酵下所產生效價之間的關聯性進行系統研究，進而有助于根據固態下的單菌落效價對菌株進行初步篩選，以達到減少阿維菌素菌種篩選工作量和提高篩選效率的目的。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?菌株。試驗菌株為河北興柏農業科技有限公司生產用菌種AV-37。

1.1.2 ? ?培養基。①單菌落及斜面孢子。組分為葡萄糖15 g/L、牛肉粉3 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、天冬氨酸0.5 g/L、瓊脂粉25 g/L。培養條件為溫度28～29 ℃，時間10～12 d。②搖瓶種子。組分為玉米淀粉25 g/L、黃豆餅粉8 g/L、花生餅粉10 g/L、酵母膏4 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈷0.01 g/L。培養條件為搖床轉速220 r/min，溫度28～29 ℃，時間45～50 h。③搖瓶發酵。組分為玉米淀粉140 g/L、淀粉酶0.6 g/L、豆餅粉25 g/L、酵母粉10 g/L、輕質碳酸鈣0.5 g/L、硫酸銨0.25 g/L、氯化鈷0.02 g/L、鉬酸鈉0.02 g/L、硫酸錳0.01 g/L。搖瓶裝量40 mL，接種量2 mL，培養條件為溫度27～28 ℃，轉速220 r/min，時間12 d。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?單菌落制備及培養。生產用斜面孢子作為出發菌株。將20 mL無菌水加入茄子瓶中，用接種環刮下孢子做成孢子懸浮液。取7 mL孢子懸浮液，加入到放置有磁力攪拌棒的規格為90 mm×15 mm的培養皿中，在磁力攪拌的作用下（轉速100 r/min），進行UVC波段（254 nm）間歇照射30 min（20 min+10 min）。取照射后的懸液1 mL進行梯度稀釋，分別取10-4～10-3稀釋液0.2 mL，與0.3 mL濃度為0.5 mol/L的氯化鋰溶液混合，涂于無菌雙碟培養基上，用牛皮紙包裹，在28～29 ℃條件下倒置培養至第4～5天，用無菌牙簽有選擇地將原菌落（An）接種至另一支雙碟培養基中，并做好相應的標識，繼續培養至11 d。