海洋真菌Arthrinium sp.次級代謝產物的研究①

李基興，李云秋

(桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 541004)

海洋廣闊而獨特的水體環境，賦予了代謝成分特殊的微生物資源和結構多樣的海洋天然產物[1]。海洋微生物種類繁多，代謝方式獨特，具有代謝產物化學多樣性等特點，海洋真菌作為海洋微生物的重要組成部分，是新穎活性次級代謝產物的重要來源之一[2]。據報道，活性次級代謝產物已成為藥物先導化合物發現的主要源泉，也為重大疾病的治療和人類的發展進步做出了極其重要的貢獻[3]。

本課題組一直致力于海洋來源真菌活性次級代謝產物的研究[4-5]，筆者對海洋來源的一株節菱孢菌屬的菌株進行其次級代謝產物的研究，從其大米發酵產物中分離并鑒定了3個化合物，即：①2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate;②dibutyl phthalate;③1H-indole-3-carbaldehyde。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

海洋來源的供試菌株保存于4 ℃環境中，將其接種到MB瓊脂固體平面培養基上，置于28 ℃培養箱中活化7 d。然后接種到MB種子培養液(麥芽提取物1.5%，海鹽1.5%，水10 ml)中于28 ℃ 、180 rpm條件下搖床活化3 d，最后再接種至大米培養基(大米200 g，海鹽1.5%，水220 ml)中，室溫下靜置發酵60 d，共發酵40瓶。

1.2 菌株鑒定

通過提取菌株的總 DNA，并對 DNA 中的Intertek Testing Services(ITS)序列進行 PCR 擴增及18S rRNA對比(18S rRNA基因序列由上海美吉生物醫藥科技有限公司測定)，將測出來的18S rRNA 基因序列進行BLAST 分析(http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/)。鑒定為Arthriniumrasikravindrae(KU 940143)，菌種保存于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器：AV-700 超導核磁共振儀(德國 Bruker 公司)，中壓制備色譜儀(Buchi 公司)，Hitachi Primade 高效液相色譜儀(日本日立公司)，ZYJ-S型超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)，旋轉蒸發儀(日本東京理化株式會社，EYELAN-1100V-W型)；主要試劑：葡聚糖凝膠 sephadexLH-20(Pharmacia 公司)，薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)，分析純化學試劑(廣州化學試劑廠和天津富宇精細化工有限公司)。

1.4 提取與分離

菌株發酵結束后將大米培養基搗碎，加入與搗碎物等體積的丙酮，超聲15 min。然后用8層紗布減壓過濾，濾液經減壓蒸餾至無有機溶劑，再用乙酸乙酯萃取3遍，減壓蒸干乙酸乙酯相得粗浸膏；殘渣用乙酸乙酯提取3遍至乙酸乙酯浸提液顏色接近無色，再經濃縮得粗浸膏，合并二者得總浸膏共125 g。粗浸膏用100～200目的硅膠拌樣，經中壓柱色譜(200～300目硅膠)分離(二氯甲烷/甲醇：100∶0～1∶1)，梯度洗脫，再經TLC檢識合并得8個流份。Fr.1經ODS中壓反相柱色譜( MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分離得3個子流份，其中 Fr. 1-3再用半制備液相(CH3CN/H2O：18%∶82%)，得到化合物3(11 mg)；Fr.3經ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分離得8個子流份，Fr.3-8再用半制備液相(CH3CN / H2O：64%∶36%)得到化合物1(22 mg)；Fr. 5 經ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O:5%∶95%～100%∶0)分離得8個子流份，其中Fr.5-8用半制備液相(MeOH/H2O：54%∶46%)得到化合物2(21 mg)。化合物結構如圖1。

圖1 化合物1～3的化學結構

2 結構鑒定

化合物1透明油狀物：1HNMR(CD3OD, 700 MHz)δ：5.38(4H, m, H-9’, 10’, 12’, 13’), 4.17(1H, dd , J = 11.2, 4.2 Hz, H-1b), 4.09(1H, dd , J=11.9, 6.3 Hz, H-1a), 3.84 (1H, m, H-2), 3.57, (2H, t , J=4.9 Hz, H-3), 2.80 (1H, t , J=7.0 Hz, H-11’), 2.37 (2H, t , J = 7.0 Hz, H-2’), 2.09 (2H, m , J=7.0 Hz, H-8’), 1.64(3H, m, H-3’), 1.36 (6H, d , H-4’, 7’, 15’), 1.35(8H, m , H-5’, 6’, 16’,17’), 0.93(3H, t , J=7.7, 6.3 Hz, H-18’)；13CNMR(CD3OD, 175 MHz)δ: 175.48 (s, C-1’), 130.9 (d, C-9’), 130.8 (d, C-10’), 129.1 (d, C-12’), 129.0 (d, C-13’), 71.1 (d, C-2), 66.5 (t, C-1), 64.1 (t, C-3), 34.9 (t, C-2’), 32.7 (t, C-7’), 30.7 (t, C-15’), 30.5 (t, C-6’), 30.3 (t, C-5’), 30.2(t, C-4’), 30.1 (t, C-3’), 28.2 (t, C-8’), 26.5 (t, C-11’), 25.9 (t, C-16’), 23.6 (t, C-17’), 14.4 (q, C-18’)。化合物 1 的核磁數據與文獻[6]對照基本一致，故鑒定該化合物為2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate。

化合物2透明油狀物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 7.72(2H, dd, J = 5.6, 3.5 Hz, H- 3, 6), 7.61(2H, dd, J=6.3, 3.5 Hz, H-4, 5), 4.29(4H, t, J=7.0 Hz, H-2’, 2’’), 1.72(4H, m, H-3’, 3’’), 1.46(4H, m, H-4’, 4’’ ), 1.31(2H, m), 0.97(6H, t, J=7.7Hz, H-5’, 5’’)。以上核磁數據與文獻[7]對照基本一致，故鑒定該化合物2為dibutyl phthalate。

化合物3透明油狀物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 9.89(1H, s, H-8), 8.16(1H, d, J=7.7 Hz, H-4), 8.10(4H, s, H-2), 7.49(1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 7.28(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-6), 7.24(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-5)；13CNMR ( CD3OD，175 MHz)δ: 187.4 (s, C-8), 139.7 (d, C-2), 138.9 (s, C-7a), 125.7 (s, C- 3a), 124.9 (d, C-6), 123.6(d, C-5), 122.4 (d, C- 4), 120.1 (s, C-3), 113.1 (d, C-7)。化合物3的核磁數據與文獻[8-9]對照基本一致，故鑒定該化合物為1H-indole-3-carbaldehyde。

3 討論

筆者對海洋來源真菌Arthriniumrasikravindrae的次級代謝產物進行了分離和鑒定，從中共獲得3個化合物。據文獻報道，化合物1是一種磷脂酶抑制劑，通過細胞膜釋放花生四烯酸而縮短了促炎物質(前列腺素、白三烯、血栓烷)的生物合成時間，具有抗病毒、抗菌活性和抗炎活性[10]。隨著海洋開采技術的發展，越來越多的海洋微生物資源將被開發和利用，本研究豐富了海洋來源真菌次級代謝產物的多樣性，也為后續活性次級代謝產物的探索和藥物先導化合物的發現及研究提供了參考。