血清、尿液和唾液在嬰幼兒巨細(xì)胞病毒DNA 檢測的應(yīng)用價值

冼劍威，邱詠佳，陳海斌，許全珍，周燕，黎念，李曉英，黎甲元

（梧州市人民醫(yī)院檢驗科兒科，廣西 梧州）

0 引言

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）的感染率非常高，尤其在免疫力低下的人群中感染率尤為突出[1]。因此 ，在胎兒、嬰幼兒、腫瘤放化療、艾滋病及自身免疫性疾病等免疫功能不成熟和免疫功能低下個體缺乏反應(yīng)能力中，HCMV 感染就會引發(fā)高發(fā)病率及病死率[2]。這就需要對HCMV 進(jìn)行早期的準(zhǔn)確診斷。為了探究血清、尿液、唾液在嬰幼兒巨細(xì)胞病毒DNA 檢測中的應(yīng)用價值，本研究采取了實時熒光定量PCR 檢測法，以探討不同類型的標(biāo)本在感染疾病診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年1 月至2019 年12 月在本院的兒科病區(qū)治療，伴有不同程度的肝功能損害的患兒。留取患兒血清、尿液、唾液樣本183 例，其中男性受檢者132 例，女性受檢者51例。年齡段在0d 至12 個月，平均年齡5 個月。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR 擴增儀為AGS-4800。HCMV-DNA定量檢測試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司HCMV 核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光法)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集

（1）血液標(biāo)本：采用含分離膠的干燥無菌真空采血管采集受檢者靜脈血2ml。

（2）尿液標(biāo)本：留取受檢者的尿液3ml，并將其放置在干燥無菌的試管中。

（3）唾液標(biāo)本：留取受檢者的唾液0.5ml，并將其放置在干燥無菌試管中。

以上標(biāo)本取得后立即通過醫(yī)院物流系統(tǒng)送至檢驗科檢測。如不能立即檢測，標(biāo)本應(yīng)在2℃-8℃冰箱保存。

1.3.2 標(biāo)本處理

（1）血液標(biāo)本：采取靜脈血2ml，4000r/min 離心5min 分離血清，取100μl 血清加入100Ul DNA 濃縮液，混勻，4000r/min 離心5min，棄上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混勻。100 ℃金屬 浴孵育10min（誤差＜1min），以12000r/min 的速率進(jìn)行離心處理，時間為5min，并取病毒DNA 上清液2μl 用來做PCR 擴張。

（2）尿液標(biāo)本：對標(biāo)本進(jìn)行混勻，并吸取3ml，將其放置在無菌離心管中，如尿液標(biāo)本渾濁，應(yīng)在37℃水浴箱浸泡10min 至尿液澄清。12000r/min 離心5min，棄上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混勻。100 ℃金屬浴孵育10min，以12000r/min 的速率進(jìn)行離心處理，時間為5min，并取上病毒DNA 上清液2μl 用來做PCR 擴張。

（3）唾液標(biāo)本：充分混勻后吸取0.5ml 于無菌離心管中，以12000r/min 的速率進(jìn)行離心處理，時間為5min，棄上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混勻。100℃金屬浴孵育10min，以12000r/min 的速率進(jìn)行離心處理，時間為5min，并取上病毒DNA 上清液2μl 用來做PCR 擴張。

1.3.3 標(biāo)本檢測

取HCMV PCR 反應(yīng)管，分別加入處理后的標(biāo)本DNA 模板2μl，瞬時離心。分別加入不同拷貝數(shù)的4 個濃度標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×104，1.0×105，1.0×106，1.0×107）DNA 模板2μl，瞬時離心。將各反應(yīng)管放入PCR 儀樣品槽中。設(shè)置循環(huán)條件：93℃ 2min 預(yù)變性，然后按93℃ 45s，55℃ 60s 共10 個循環(huán)，最后按93℃ 30s，55℃ 45s，做30 個循環(huán)，于55℃ 45s 末收集熒光信號。同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)是陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品的CT值，以CT 值來計算病毒DNA 的病毒載量。陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為DNA 拷貝數(shù)≥500 拷貝/ml，＜500 拷貝/ml 則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 14.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中計量資料采用（±s）表示，并進(jìn)行t 檢驗，計數(shù)資料采用（%）表示，并進(jìn)行χ2檢驗，以P＜0.05 為差異學(xué)有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

183 例受檢患兒血清標(biāo)本HCMV-DNA 陽性率為2.19%；尿液標(biāo)本HCMV-DNA 陽性率為28.42%；唾液標(biāo)本HCMVDNA 陽性率為29.51%。尿液標(biāo)本與血清標(biāo)本差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=54.309,P＜0.05），唾液標(biāo)本與血清標(biāo)本差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=57.008,P＜0.05），尿液標(biāo)本與唾液標(biāo)本差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.053,P＞0.05）。見表1。47 例尿液和唾液同時陽性的病例，尿液樣本HCMV-DNA 載量為（4.07±1.06），唾液樣本HCMV-DNA 載量為（4.97±1.63），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.817，P＜0.05）。唾液樣本中HCMV-DNA 載量明顯高于尿液。

表1 183 例患兒血清、尿液和唾液HCMV-DNA 陽性率比較

3 討論

嬰幼兒巨細(xì)胞病毒性肝炎是一種常見的肝炎類型，其在嬰幼兒發(fā)病中占有較大的比例[3,4]。一旦患病后會對患兒的肝功能造成損害，主要的臨床表現(xiàn)為黃疸、肝臟腫大等，若不及時進(jìn)行治療將會對生命安全造成威脅。巨細(xì)胞病毒在感染人體后，其排出的途徑主要為唾液、乳液、尿液及宮頸分泌物，且呈現(xiàn)出長期間歇性，通過口腔、產(chǎn)道、胎盤、哺乳、器官或骨髓移植等途徑傳播[5,6]。目前，檢測HCMV 的常用方法有血清抗體檢測、病毒抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、熒光定量PCR 技術(shù)檢測和尿液DNA 水平等[7,8]。選擇合適的標(biāo)本類型和檢測方法，能準(zhǔn)確而高效的檢出巨細(xì)胞病毒，為診斷及治療提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，183 例嬰幼兒受檢者血清、尿液、唾液標(biāo)本HCMV-DNA 的總陽性率分別為2.19%、28.42%、29.51%。尿液和唾液標(biāo)本的HCMV-DNA 陽性率明顯高于血清標(biāo)本的HCMV-DNA 陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在三類不同的標(biāo)本類型中，唾液標(biāo)本的HCMVDNA 載量明顯高于尿液標(biāo)本，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示不同類型的標(biāo)本會對HCMV 的陽性率及病毒載量檢測產(chǎn)生較大的影響。在嬰幼兒群體中，血清HCMV-DNA 檢出率低，且有采血較困難、血清樣本溶血率較高等影響因素，因此，不推薦使用血清作為檢測HCMV-DNA 的標(biāo)本類型。采用唾液和尿液兩種類型標(biāo)本，能提高HCMV-DNA 檢測的陽性率，唾液標(biāo)本有容易獲取、無創(chuàng)性等特點，且相對于尿液有更高一數(shù)量級的病毒載量，因此，唾液標(biāo)本可作為尿液標(biāo)本的有效補充，也可作為與尿液標(biāo)本同時檢測，以提高在拷貝數(shù)較低的標(biāo)本中減少由于樣本保存、提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線等多種因素可能造成的漏檢，提高檢測陽性率，以協(xié)助臨床做出早期診斷與治療效果評價與監(jiān)測。