MSPD-UPLC 法同時測定狼毒大戟中4 種成分

劉 雷 馬玉坤 孫 宇 劉 琦 張金玲 郭麗娜 劉吉成

（齊齊哈爾醫學院， 黑龍江 齊齊哈爾161006）

狼毒大戟為大戟科大戟屬植物狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.的干燥根［1］，狼毒大戟始載于《神農本草經》，其味苦、辛，性平，有毒，具有泄水逐飲、破積殺蟲的功效，主治水腫腹脹、痰食蟲積、心腹疼痛、結核、疥癬等，臨床上常用來治療腫瘤、癲癇等［2］。狼毒大戟在我國資源豐富，主要分布于黑龍江、吉林、內蒙古等地。

研究表明，狼毒大戟中所含有的二萜內酯類為其主要活性成分。其中松香烷型二萜的研究報到較多，目前已經從狼毒大戟中分離發現27個松香烷型二萜類化合物［3］。在這些化合物中，巖大戟內酯A（Jolkinolide A，JA）、17-羥基-巖大戟內酯A（17-hydroxyjolkinolide A，17-JA）、巖大戟內酯B（Jolkinolide B，JB）、7-羥基-巖大戟內酯B（17-hydroxyjolkinolide B，17-JB），4個化合物為其主要活性成分。Xu 等［4］研究發現JB 對PI3K／Akt／mTOR 信號通路有較強的抑制作用，能夠顯著誘導mcf-7 細胞凋亡。Wang 等［5］研究發現JB 可以通過下調PI3K／Akt 和IAP 家族蛋白來促進U937 細胞的凋亡，此外，caspase-3 和caspase-9 激活的觸發介導了凋亡誘導。Takuhiro 等［6］研究發現17-JB 可有效抑制LPS 誘導的炎性介質的產生，如前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO） 和促炎細胞因子，表明17-JB 在巨噬細胞中具有抗炎作用，并且可以為炎癥疾病提供潛在的治療方法。Wang 等［7］發現17-JA 對RANKL 誘導的原代骨髓巨噬細胞（BMMS） 破骨細胞的形成有明顯的抑制作用，通過阻止破骨細胞的形成及其骨吸收活性，對骨丟失具有抑制作用。

由于JA、17-JA、JB 及17-JB 具有廣泛的生物活性，因此對其進行定量分析對控制狼毒大戟藥材質量具有重要意義。目前，已報導的狼毒大戟藥材的指標成分定量檢測方法主要有薄層色譜法、液相色譜法及液相-質譜聯用法［8-10］等。基質分散固相萃取（MSPD） 技術是1989 年提出的新型前處理方法［11］。該方法的優勢是將樣品的破碎、提取及分離集成于一個步驟中，再根據目標分析物的分子結構特征及分散劑的不同性質，通過優化實驗選擇出最佳的分散劑及洗脫溶劑，利用研缽及分散劑將樣品磨碎并充分混勻，之后，再用適合的流動相洗脫，將目標分析物洗脫出并進行色譜定量分析。實驗過程中不需要加熱處理，這種溫和的萃取條件可以避免目標分析物的降解，過程操作簡便沒有過多的樣品轉移減少目標分析物的損失。近年來，MSPD 法已成功地應用于藥用植物材料中多種活性物質的提取，為藥用植物樣品前處理提供了一種有效、簡便的方法［12-14］。本研究的目的是建立一種實用、簡便、快速的方法，利用基質分散固相萃取法處理狼毒大戟藥材，采用UPLC 法檢測其中的松香烷型二萜JA、17-JA、JB 及17-JB 的含有量，以期為狼毒大戟藥材的進一步研究提供參考。

1 材料

Waters Acquity UPLC Class 超高效液相色譜儀（配有四元泵、真空脫氣機，樣品管理器、PDA 二極管陣列檢測器及Empower 3 色譜工作站）、色譜柱采用Waters BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）反相柱（美國Waters 公司）；Merck Millipopre Synergy 制水系統（德 國Merck 公 司）；Eppendorf 5417R 高速離心機（德 國 Eppendorf 公 司）；Branson 3800型超聲清洗器（美國Branson 公司）。

對照品JA、17-JA、JB 及17-JB 由本實驗室自制，其1H-NMR、13C-NMR、MS 數據與文獻報道的結果一致［15］，純度經HPLC 檢測大于98%。乙腈及甲醇（色譜級） 均購自于德國默克公司，其他試劑均為國產分析純。硅膠（200～300目） 購于山東青島海洋公司；C18填料（平均粒徑50 μm）購于日本YMC 公司；中性氧化鋁（200～300目）、佛羅里硅土（100～200目） 購于國藥集團。

不同地區采集的狼毒大戟藥材3 份，經齊齊哈爾醫學院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.的干燥根。標本保存于齊齊哈爾醫學院天然藥物化學實驗中心。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取4 種目標分析物對照品適量，置于25 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL 分別含JA、17-JA、JB、17-JB、180.4、114.、699.2、530.0 μg 的混合對照品溶液，過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，即得。

2.2 MSPD 法 將狼毒大戟藥材切成小塊干燥至恒定質量，用中藥粉碎機將其粉碎，并過100目篩。精密稱取0.1 g 藥材粉末和0.3 g 硅膠置于瑪瑙研缽中，充分研磨至樣品與分散劑完全混勻。將分散后的樣品轉移至底部鋪有一層脫脂棉的萃取柱中作為固定相，之后在固定相的頂部添加另一層脫脂棉，并用玻璃棒輕壓使固定相壓實。利用固相萃取裝置減壓洗脫，加入6.0 mL 乙腈，洗脫液收集到10 mL 量瓶中，用乙腈定溶至刻度線。最后，將洗脫液以13 000 r／min 離心5 min，上清液用于色譜分析。

2.3 超聲提取法 精密稱取狼毒大戟粉末1.0 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精確加入50.0 mL乙腈，稱定錐形瓶的總質量。于室溫下超聲（250 W） 提取30 min，提取后使用乙腈補足失質量。提取液過濾，取續濾液5 mL 置于10 mL 量瓶中，使用乙腈定容至刻度，過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，收集續濾液進行UPLC 分析。

2.4 索氏提取法 精密稱取狼毒大戟粉末1.0 g，使用濾紙密封，放置于索氏提取裝置內，圓底燒瓶中加入100 mL 乙腈，用恒溫水浴鍋加熱回流2 h，回流結束后放冷，過濾置100 mL 量瓶中，使用乙腈定容至刻度，過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，收集續濾液進行UPLC 分析。

2.5 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0～1.5 min，45%A；1.5～3 min，45%～65%A；3～7.5 min，65%A；7.5～8 min，65%～45%A；8～10 min，45%A）；體積流量0.4 mL／min；檢測波長250 nm；柱溫35℃；進樣量3 μL。

3 結果與分析

3.1 萃取條件優化 作為一種有效的提取方法，MSPD 濃縮了傳統的樣品前處理中所需的樣品均化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，避免了樣品均化、沉淀、離心、轉移、乳化、濃縮等造成的被測物的損失［16］。MSPD 萃取過程的效率和選擇性是由多種因素決定的，在本研究過程中，為了獲得目標成分的最大萃取量，對影響萃取效率的主要參數進行了優化，包括分散劑、樣品與分散劑的質量比、洗脫溶劑、洗脫溶劑的體積等4個參數。

3.1.1 分散劑的影響 分散劑的性質是MSPD 過程中的一個重要參數，分散劑對促進溶劑與樣品的相互作用，提高萃取效率和對目標分析物的選擇性起著至關重要的作用。更重要的是它可以影響洗脫過程，分散劑不僅作為固定相起到吸附和分離樣品的作用，還作為研磨和混勻材料來破碎和分散樣品。本研究對常用的不同性質的分散劑硅膠、C18、中性氧化鋁和佛羅里硅土進行評價。圖1 顯示，以硅膠和C18為分散劑提取各目標化合物的提取率明顯高于中性氧化鋁和佛羅里硅土。可能是因為硅膠和C18骨架上鍵合了較多的羥基結構，與目標化合物分子間形成氫鍵有關。當使用硅膠作為分散劑時，目標成分的萃取率略高于C18，故本實驗采用硅膠為分散劑。

圖1 分散劑對各成分萃取率的影響Fig.1 Effects of the dispersant on extraction yields of various constituents

3.1.2 樣品與分散劑質量比的影響 樣品與分散劑的質量比影響目標化合物的萃取效率，是MSPD過程中的另一個重要參數，其適當的配比可以改變樣品與分散劑的接觸面積。本研究分別考察樣品與硅膠分散劑的1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等6個質量配比。圖2 顯示，4個目標化合物的萃取率隨著硅膠分散劑的增加而增加，配比為1∶4時達到最大值，質量比為1∶5 之后萃取率開始下降，因此本實驗選擇樣品與硅膠分散劑的質量比為1∶4。

圖2 樣品與硅膠的質量比對各成分萃取率的影響Fig.2 Effects of mass ratios of sample to silica on extraction yields of various constituents

3.1.3 洗脫溶劑的影響 在MSPD 過程中，洗脫溶劑作為流動相促進目標化合物與分散劑相互作用，提高萃取效率，對提高目標分析物的選擇性起著重要作用，適合的洗脫溶劑可以保證從復雜樣品組分中選擇性地萃取目標分析物。本研究考察了石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙醇等不同極性的洗脫溶劑，以篩選出合適的最佳洗脫溶劑。由圖3 可以看出，與其他4 種溶劑相比，乙腈的洗脫效率最高，故本實驗選擇乙腈作為洗脫溶劑。

圖3 洗脫溶劑對各成分萃取率的影響Fig.3 Effects of elution solvents on extraction yields of various constituents

3.1.4 洗脫溶劑體積的影響 充足的洗脫溶劑體積也是本實驗中的一個關鍵參數，為尋找到完全洗脫各目標分析物所需的最小洗脫溶劑用量，本實驗考察了乙腈的洗脫用量從2.0 mL 到8.0 mL，圖4表明，各目標分析物的萃取率在洗脫溶劑用量為6.0 mL 時已經達到最大值，故本實驗選擇6.0 mL乙腈作為洗脫溶劑體積。

圖4 洗脫溶劑體積對各成分萃取率的影響Fig.4 Effects of volumes of elution solvent on extraction yields of various constituents

3.2 方法學考察 在對MSPD 程序進行綜合優化后，在最優實驗條件下，從線性關系、檢出限、定量限、精密度、穩定性及回收率等方面全面驗證本研究所建立MSPD-UPLC 方法的各方面性能特點。

3.2.1 線性關系考察 精密量取“2.1” 項下混合對照品溶液3.00、2.00、1.00、0.50、0.30、0.10 mL，分別置于10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，獲得6 梯度質量濃度的混合對照品溶液，分別過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，在“2.5” 項色譜條件下進樣。以色譜峰面積為縱坐標（Y），混合對照品的質量濃度為橫坐標（X），進行回歸。檢出限和定量限分別為目標分析物的信噪比（S／N）3∶1和10∶1 的質量濃度。結果見表1。

3.2.2 精密度、穩定性試驗 取已制得的同一MSPD 樣品，在“2.5” 項色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h 進樣，測定日內精密度；分別于0、24、48 h 進樣，測定日間精密度。測得JA、17-JA、JB 及17-JB 的日內精密度RSD 分別為1.7%、1.0%、1.3%、1.4%；日間精度RSD 分別為1.1%、1.5%、1.7%、2.0%。表明儀器精密度、樣品穩定性良好。

3.2.3 加樣回收率試驗 對樣品中各目標分析物的3個加樣濃度（50%、100%、150%） 的回收率進行測試，結果見表2，得各目標分析物的回收率93.0%～94.4%，其RSD 1.3%～1.9%。

3.3 方法比較 為了評價本研究所提出的MSPD法的性能，對優化后的MSPD 與索氏提取法、超聲提取法進行了比較，見表3，結果表明，MSPD 法對各目標分析物的提取率高于索氏提取法、超聲提取法。并且MSPD 法在測定過程中僅需0.1 g 樣品、6.0 mL 有機溶劑、15 min 即可完成萃取。因此，與索氏提取法和超聲提取法相比較，MSPD 法在樣品和有機溶劑的消耗量、環保、實驗成本、萃取過程簡便程度和方法耗時等多個方面均具有優勢，且實驗過程中無需加熱，可防止目標分析物的降解。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

3.4 樣品分析 為了驗證MSPD-UPLC 方法的適用性，按照優化后的條件對不同地區采集的狼毒大戟樣品（樣品1～3） 中各成分進行分析，結果見表4，色譜圖見圖5 示。結果表明不同地區采集的狼毒大戟藥材中各目標分析物的含有量有較大差異，不同生長環境及生長年限可能是其含有量差異的主要原因。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 方法比較Tab.3 Comparison of methods

圖5 各成分UPLC 色譜圖Fig.5 UPLC chromatograms of various constituents

表4 各樣品分析（μg／g， x±s， n＝3）Tab.4 Analysis of various samples（μg／g， x±s， n＝3）

4 結論

本研究建立了一種簡便、有效、快速的MSPD-UPLC 聯用法同時提取測定狼毒大戟中4 種成分的含有量。在3個實際樣品的檢測中驗證了該方法用于常規分析的可行性，取得了較好的效果。該方法可通過適當改變提取條件，以期用于其他藥材中的活性指標成分的提取和檢測。